Tradicionālās diagnostikas stratēģijas infekcijas slimību noteikšanai prasa izmantot galda instrumentus, kas nav piemēroti pārbaudes punktam (POCT).Jaunā mikrofluidika ir ļoti miniaturizēta, automatizēta un integrēta tehnoloģija, kas ir potenciāla alternatīva tradicionālajām metodēm ātrai, zemu izmaksu un precīzai diagnostikai uz vietas.Molekulārās diagnostikas metodes tiek plaši izmantotas mikrofluidiskajās ierīcēs kā visefektīvākās metodes patogēnu noteikšanai.Šajā pārskatā ir apkopoti jaunākie sasniegumi infekcijas slimību molekulārajā diagnostikā, kas balstīta uz mikrofluīdiem, gan no akadēmiskā, gan rūpnieciskā viedokļa.Pirmkārt, mēs aprakstām tipisku nukleīnskābju apstrādi mikroshēmā, tostarp paraugu pirmapstrādi, pastiprināšanu un signāla nolasīšanu.Pēc tam tiek salīdzinātas četru veidu mikrofluidisko platformu īpašības, priekšrocības un trūkumi.Tālāk mēs apspriedīsim digitālo testu izmantošanu nukleīnskābju absolūtai kvantitatīvai noteikšanai.Gan klasiskās, gan jaunākās komerciālās, uz mikrofluīdiem balstītas molekulārās diagnostikas ierīces ir apkopotas kā pierādījums pašreizējam tirgus stāvoklim.Visbeidzot, mēs piedāvājam turpmākos virzienus infekcijas slimību mikrofluidiskajai diagnostikai.
Infekcijas slimības izraisa patogēni, tostarp baktērijas, vīrusi un parazīti, kas ir izplatīti visā pasaulē.Atšķirībā no citām slimībām, patogēni ātri inficējas un izplatās starp cilvēkiem un saimniekdzīvniekiem, izmantojot inokulāciju, gaisa un ūdens vidi [1].Infekcijas slimību profilakse ir ļoti svarīgs sabiedrības veselības pasākums.Trīs galvenās stratēģijas infekcijas slimību apkarošanai: (1) kontrolēt infekcijas avotu;(2) pārraides ceļa pārtraukums;(3) uzņēmīgo populāciju aizsardzība.Starp galvenajām stratēģijām infekcijas avota kontrole tiek uzskatīta par vissvarīgāko stratēģiju tās ērtības un zemo izmaksu dēļ.Inficēto personu ātra diagnostika, izolēšana un ārstēšana ir ļoti svarīga, tāpēc ir nepieciešamas ātras, jutīgas un precīzas diagnostikas stratēģijas [2].Pašreizējā infekcijas slimību diagnoze parasti apvieno klīnisko izmeklēšanu, kas balstīta uz pazīmēm un simptomiem, un laboratoriskiem pētījumiem, piemēram, šūnu kultūru un molekulāro diagnostiku, kam nepieciešams apmācīts personāls, darbietilpīgas procedūras un dārgas testēšanas iekārtas [3, 4].Infekcijas slimību uzliesmojumu novēršanai nepieciešama ātra, lēta un precīza lokāla diagnostika, īpaši ierobežotu resursu apgabalos, kur infekcijas slimības ir izplatītas un smagas [5], kā arī ārstēšana tuksnesī vai kaujas laukā, kur ārkārtas situācijas nav paredzamas..medicīniskā aprūpe ir ierobežota [6].Šajā kontekstā mikrofluidika ir tehnoloģija, kas apvieno mikroelektromehānisko sistēmu tehnoloģijas, nanotehnoloģiju vai materiālu zinātni precīzai manipulācijai ar šķidrumu [7,8,9,10], sniedzot jaunas iespējas aprūpes punktu noteikšanai (POCT).) infekcijas izraisītāji ārpus slimnīcām un laboratorijām.Salīdzinot ar tradicionālo laikietilpīgo diagnostiku, mikrofluidiskā tehnoloģija piedāvā paraugu un izmaksu ietaupījumus molekulārajai diagnostikai slimību uzliesmojumu laikā.Koronavīrusa slimības 2019 (COVID-19) globālo izplatību izraisa smaga akūta respiratorā sindroma koronavīruss 2 (SARS-CoV-2), tāpēc vēlreiz tiek uzsvērta mikrofluidikas nozīme pandēmijas savlaicīgai profilaksei un kontrolei [11, 12 , 13].Atšķirībā no tradicionālās diagnostikas, mikrofluidiskā POCT izmanto nelielas pārnēsājamas ierīces, sākot no galda analizatoriem līdz mazām sānu testa strēmelēm, lai pārbaudītu paraugu ņemšanas vietas tuvumā [14].Šajos testos ir vienkāršota parauga sagatavošana vai bez tās, ātra signāla pastiprināšana un jutīgi signāla nolasījumi, kas nodrošina īsu laiku un precīzus rezultātus dažu minūšu laikā.Uz mikrofluīdiem balstītu veselības aprūpes instrumentu pieejamība un masveida ražošana ir paplašinājusi to rentablas un tiešas diagnostikas pielietojumu ārpus slimnīcas, pacienta tuvumā un pat mājās.
Starp esošajām infekcijas slimību diagnostikas stratēģijām molekulārā diagnostika ir viena no jutīgākajām [15, 16].Turklāt molekulāro diagnostiku bieži izmanto kā zelta standartu nepārtrauktai COVID-19 noteikšanai, kas ļauj tieši noteikt vīrusam raksturīgos RNS vai DNS reģionus pirms imūnās atbildes reakcijas sākuma [17, 18].Šajā pārskatā mēs iepazīstinām ar jaunākajiem sasniegumiem infekcijas slimību molekulārās diagnostikas procesos, kuru pamatā ir mikrofluidika, no akadēmiskā viedokļa līdz nākotnes rūpnieciskām perspektīvām (1. att.).Mēs sāksim ar trim galvenajiem soļiem nukleīnskābju noteikšanā: mikroshēmas parauga pirmapstrāde, nukleīnskābju pastiprināšana un signāla nolasīšana.Pēc tam mēs salīdzinājām dažāda veida mikrofluidiskās platformas ar to struktūru un funkcijām, parādot unikālas īpašības (stiprās un vājās puses).Digitālā nukleīnskābju noteikšana tiek tālāk apspriesta un sniegta kā trešās paaudzes tehnoloģijas piemērs infekcijas patogēnu molekulu absolūtai kvantitatīvai noteikšanai.Turklāt tiks prezentētas vairākas tipiskas un jaunākās komerciālās POCT ierīces, lai demonstrētu pašreizējo stāvokli molekulārās diagnostikas mikrofluidiskā POCT tirgū.Mēs arī apspriedīsim un skaidrosim savu redzējumu par turpmākajiem pieteikumiem.
Mikrofluidisko mikroshēmu moduļus nukleīnskābju noteikšanai var iedalīt trīs kategorijās (paraugu ņemšana, atpazīšana un signalizācija) pēc to funkcijām [19].Starp šiem moduļiem paraugu ņemšanas modulis galvenokārt realizē paraugu līzi un nukleīnskābju ekstrakciju.Sensora modulis galvenokārt kontrolē nukleīnskābju signālu pārveidošanu un pastiprināšanu.Signalizācijas modulis nosaka signālu, ko konvertē un apstrādā sensors modulis.Pamatojoties uz nukleīnskābju noteikšanas procesu mikroshēmā, mēs apkoposim dažādas mikroshēmas, kas var realizēt “ievades un izvades” funkciju.
Pirmais nukleīnskābes noteikšanas solis ir nukleīnskābes ekstrakcija, ti, mērķa nukleīnskābes izolēšana no sākotnējā parauga.Nukleīnskābju ekstrakcija tiek veikta, lai attīrītu nukleīnskābes no citiem molekulāriem piesārņotājiem, nodrošinātu nukleīnskābju molekulu primārās struktūras integritāti un optimizētu rezultātus.Nukleīnskābju ekstrakcijai nepieciešama nepieciešamā parauga līze un nukleīnskābju uztveršana, kuras kvalitātei un efektivitātei ir milzīga ietekme uz pētījumu un diagnostikas rezultātiem.Jebkuras smalkas blakusparādības ekstrakcijas laikā var ierobežot turpmāku noteikšanu.Piemēram, polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) un cilpas izotermiskās amplifikācijas (LAMP) metodes inhibē daži organiskie šķīdinātāji, piemēram, etanols un izopropanols nukleīnskābju izolācijas reaģentos [20].Šķidruma-šķidruma ekstrakcija un cietās fāzes ekstrakcija ir vispopulārākās nukleīnskābju izolēšanas metodes [21], tomēr šķidruma-šķidruma ekstrakcija uz mikroshēmas ir ļoti ierobežota, jo šķidruma-šķidruma ekstrakcijā izmantotie reaģenti izraisa vairuma mikrofluidisko mikroshēmu koroziju. .Šeit mēs izceļam uz mikroarray balstītas cietās fāzes ekstrakcijas metodes un salīdzinām to priekšrocības un trūkumus.
Silīcijs ir substrāta materiāls, kas ir saderīgs ar nukleīnskābēm tā bioloģiskās saderības, stabilitātes un vieglas modifikācijas dēļ [22].Svarīgi, ka, modificējot ar silīcija dioksīdu vai citiem materiāliem, šim kompozītam piemīt īpašības, kas adsorbē negatīvi lādētas nukleīnskābes zemā pH un augsta sāls apstākļos, vienlaikus eluējot ar augstu pH un zemu sāls šķīdumiem.Pamatojoties uz šo parādību, ir iespējams attīrīt nukleīnskābi.
Nukleīnskābju ekstrakcijai mikrofluidikā ir izmantotas dažādas silīcija dioksīda bāzes materiālu formas, piemēram, silīcija dioksīda lodītes, pulveri, mikrošķiedras filtri un silīcija dioksīda membrānas [23, 24, 25, 26].Atkarībā no materiāla īpašībām, materiālus uz silīcija bāzes var izmantot mikroshēmās dažādos veidos.Piemēram, silīcija dioksīda granulas, pulverus un komerciālos nanofiltrus var vienkārši ievietot mikrofluidisko mikroshēmu porās vai mikrokanālos un palīdzēt no paraugiem iegūt nukleīnskābes [27, 28, 29].Virsmas modificētas silīcija dioksīda membrānas var izmantot arī, lai ar zemām izmaksām ātri attīrītu DNS no patogēniem.Piemēram, Wang et al.[30] Apvienojot denaturēšanas amplifikācijas reakcijas ar pūslīšu izraisītu ķēdes apmaiņu ar silīcija dioksīda membrānām, kas pārklātas ar hitozāna oligosaharīdiem, tika ieviesta daudzpusīga pārnēsājama sistēma, kas veiksmīgi atklāja 102–108 kolonijas veidojošas vienības.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., un vīrusa klātbūtne bija viegli pamanāma.Pauels u.c.[31] Pēc tam C hepatīta vīrusa (HCV), cilvēka imūndeficīta vīrusa (HIV), Zikas vīrusa un cilvēka papilomas vīrusa noteikšanai un automātiskai pavairošanai tika izmantoti uz silīcija bāzes veidoti mikromasīvi, kuros RNS vīrusu uztveršanai tika izstrādāts 1,3 μl līkumots mikroreaktors.un veic in situ pastiprināšanu.Papildus šīm metodēm nukleīnskābju ekstrakcijā galvenā loma ir arī virsmas modificētajām silīcija dioksīda mikrokolonnām, jo modificējošā materiāla ģeometrija un īpašības ievērojami palielina ekstrakcijas efektivitāti.Chen et al.[32] ierosināja mikrofluidisku platformu zemas koncentrācijas RNS izolēšanai, pamatojoties uz aminoskābēm pārklātām silīcija mikrokolonnām.Šī mikrofluidiskā ierīce integrē 0,25 cm2 mikropilāru masīvu uz silīcija substrāta, lai panāktu augstāku ekstrakcijas efektivitāti, izmantojot lielu virsmas laukuma un tilpuma attiecību.Šīs konstrukcijas priekšrocība ir tāda, ka mikrofluidiskā ierīce var sasniegt līdz pat 95% nukleīnskābju ekstrakcijas efektivitāti.Šīs uz silīciju balstītās stratēģijas parāda ātri izolētu nukleīnskābju vērtību ar zemām izmaksām.Kombinācijā ar mikrofluidiskām mikroshēmām uz silīciju balstītas ekstrakcijas stratēģijas var ne tikai palielināt nukleīnskābju noteikšanas efektivitāti, bet arī atvieglot analītisko ierīču miniaturizāciju un integrāciju [20].
Magnētiskās atdalīšanas metodes izmanto magnētiskās daļiņas, lai izolētu nukleīnskābes ārējā magnētiskā lauka klātbūtnē.Parasti izmantotās magnētiskās daļiņas ietver Fe3O4 vai γ-Fe2O3 magnētiskās daļiņas, kas pārklātas ar silīcija dioksīdu, aminoskābju un karboksilgrupu [33,34,35,36].Magnētisko daļiņu atšķirīgā iezīme salīdzinājumā ar SPE metodēm, kuru pamatā ir silīcijs, ir ērta manipulācija un kontrole ar ārējiem magnētiem.
Izmantojot elektrostatisko mijiedarbību starp nukleīnskābēm un silīcija dioksīdu, augsta sāls un zema pH apstākļos nukleīnskābes adsorbējas uz silīcija dioksīda pārklājuma magnētisko daļiņu virsmas, savukārt zema sāls un augsta pH apstākļos molekulas var mazgāt. atkal..Ar silīcija dioksīdu pārklātas magnētiskās lodītes ļauj iegūt DNS no liela apjoma paraugiem (400 μL), izmantojot magnētiski kontrolētu kustību [37].Kā demonstrāciju Rodrigess-Mateoss u.c.[38] izmantoja noskaņojamus magnētus, lai kontrolētu magnētisko lodīšu pārnešanu uz dažādām kamerām.Pamatojoties uz ar silīcija dioksīdu pārklātām magnētiskajām daļiņām, no notekūdeņu paraugiem var iegūt 470 kopijas/ml SARS-CoV-2 genoma RNS LAMP reversās transkripcijas noteikšanai (RT-LAMP), un atbildi var nolasīt 1 stundas laikā.ar neapbruņotu aci (2.a att.).
Ierīces, kuru pamatā ir magnētiski un poraini materiāli.IFAST RT-LAMP mikrofluidiskās ierīces konceptuālā diagramma SARS-CoV-2 RNS noteikšanai (pielāgots no [38]).b Centrbēdzes mikroierīce vaiga tamponu nukleīnskābes dSPE (pielāgots no [39]).c Iebūvēts parauga koncentrators, kas darbojas ar pašenerģiju, izmantojot FTA® karti (pielāgots no [50]).d Fusion 5 filtrpapīrs, kas modificēts ar hitozānu (pielāgots no [51]).SARS-CoV-2 smaga akūta respiratorā sindroma koronavīruss 2, RT-LAMP reversās transkripcijas cilpas mediēta izotermiskā amplifikācija, FTA meklētāju tehnoloģiju partneri, NA nukleīnskābe
Pozitīvi lādētas magnētiskās daļiņas ir ideāli piemērotas nukleīnskābes fosfāta mugurkaula pievienošanai.Pie noteiktas sāls koncentrācijas negatīvi lādētās nukleīnskābju fosfātu grupas var būt pozitīvi uzlādētas uz magnētisko kompozītu daļiņu virsmas.Tāpēc nukleīnskābju ekstrakcijai tika izstrādātas magnētiskās nanodaļiņas ar raupju virsmu un augstu aminogrupu blīvumu.Pēc magnētiskās atdalīšanas un bloķēšanas magnētiskās nanodaļiņas un DNS kompleksus var tieši izmantot PCR, kas novērš nepieciešamību veikt sarežģītas un laikietilpīgas attīrīšanas un eluēšanas darbības [35].Magnētiskās nanodaļiņas, kas pārklātas ar negatīvām karboksilgrupām, ir izmantotas arī, lai atdalītu uz virsmām adsorbētas nukleīnskābes augstas koncentrācijas polietilēnglikola un nātrija hlorīda šķīdumos [36].Izmantojot šīs virsmas modificētās magnētiskās lodītes, DNS ekstrakcija ir savietojama ar turpmāko pastiprināšanu.Dignan et al.[39] aprakstīja automatizētu un pārnēsājamu centrbēdzes mikrofluidisku platformu nukleīnskābju pirmapstrādei, ļaujot netehniskajam personālam to izmantot uz vietas.Turklāt izolētās DNS saderība ar LAMP — metodi, kas ir labi piemērota nukleīnskābju analīzei aprūpes punktā, vēl vairāk parāda minimālās aprīkojuma prasības un piemērotību kolorimetriskajām pārbaudēm (2.b attēls).
Magnētiskās lodītes metodes piedāvā automatizētas ekstrakcijas iespēju, dažas no tām pastāv komerciālos automatizētos nukleīnskābju ekstraktoros [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ASV), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekina, Ķīna) un Biomek®;Bekmens (Maiami, ASV).), Florida, ASV)].Magnētisko lodīšu un mikrofluidikas apvienošanas priekšrocības var izmantot efektīvai automatizētai nukleīnskābju ekstrakcijai, kas potenciāli varētu veicināt molekulārās diagnostikas attīstību;tomēr magnētisko lodīšu kombinācija ar mikrofluidiku joprojām lielā mērā ir atkarīga no sarežģītām vadības sistēmām, lai precīzi manipulētu ar magnētiskajām lodītēm, kas izskaidro komerciālo produktu popularitāti, kas ir apjomīgi un dārgi, kas ierobežo turpmāku magnētisko lodīšu izmantošanu POCT.
Nukleīnskābju noteikšanai ir izmantoti arī vairāki poraini materiāli, piemēram, modificēti nitrocelulozes filtri, Finders Technology Associates (FTA) kartes, uz poliētersulfona bāzes izgatavoti filtrpapīri un ar glikānu pārklāti materiāli [40, 41, 42, 43, 44].Porainus šķiedru materiālus, piemēram, šķiedru papīru, vispirms izmantoja DNS izolēšanai, fiziski sapinoties ar šķiedrām garās virknes DNS molekulas.Mazas poras izraisa spēcīgu DNS molekulu fizisko ierobežojumu, kas pozitīvi ietekmē DNS ekstrakciju.Šķiedru papīra atšķirīgo poru izmēru dēļ ekstrakcijas efektivitāte nevar apmierināt DNS amplifikācijas vajadzības [45, 46].FTA karte ir komerciāls filtrpapīrs, ko izmanto tiesu medicīnas jomā un plaši izmanto citās molekulārās diagnostikas jomās.Izmantojot celulozes filtrpapīru, kas piesūcināts ar dažādām ķīmiskām vielām, lai lizētu paraugā esošās šūnu membrānas, atbrīvotā DNS tiek aizsargāta no degradācijas līdz 2 gadiem.Pavisam nesen tika izstrādāts impregnēts celulozes papīrs dažādu patogēnu, tostarp SARS-CoV-2, leišmaniozes un malārijas, molekulārai noteikšanai [47, 48, 49].HIV izolētajā plazmā tiek tieši lizēts, un vīrusa nukleīnskābe tiek bagātināta koncentratorā iebūvētajā FTA® plūsmas membrānā, kas ļauj efektīvi ražot nukleīnskābi [50] (2.c att.).Galvenā problēma ar nukleīnskābju noteikšanu, izmantojot FTA kartes, ir tāda, ka tādas ķīmiskas vielas kā guanidīns un izopropanols kavē turpmākās amplifikācijas reakcijas.Lai atrisinātu šo problēmu, mēs izstrādājām Fusion 5 hitozānu modificētu filtrpapīru, kas apvieno gan DNS molekulu un šķiedru filtrpapīra fiziskās savijas priekšrocības, gan DNS elektrostatisko adsorbciju uz hitozānu modificētiem savienojumiem, lai panāktu ļoti efektīvu nukleīnskābju ekstrakciju. ..filtra šķiedras [51] (2.d att.).Līdzīgi Zhu et al.[52] demonstrēja ar hitozānu modificētu PCR metodi, kuras pamatā ir in situ kapilāra mikrofluidiskā sistēma ātrai Zikas vīrusa RNS izolēšanai un noteikšanai.Nukleīnskābes var attiecīgi adsorbēt/desorbēt jauktā lizāta/PCR vidē, pamatojoties uz hitozāna ieslēgšanas/izslēgšanas īpašību.ieslēgts un izslēgts”, reaģē uz pH.
Kā minēts iepriekš, šīs stratēģijas apvieno dažādu cietās fāzes materiālu priekšrocības un palielina nukleīnskābju ekstrakcijas efektivitāti mikrofluidikā.Praktiskā pielietojumā šo materiālu izmantošana lielos daudzumos ir neekonomiska, un arī pareiza virsmas apstrāde vai parasto materiālu virsmas modificēšana ar šiem materiāliem var arī saglabāt to funkcijas.Tāpēc tiek uzskatīts, ka šo stratēģiju īstenošana pēc izmēģinājuma pētījuma var samazināt izmaksas.
Nukleīnskābju testēšanai uz mikrofluidiskajām platformām bieži tiek izmantoti nelieli parauga tilpumi (< 100 µl), tādēļ mērķa nukleīnskābju pastiprināšana ar īpašām zondēm, lai pārveidotu to signālā, kas ir ērts pakārtotai noteikšanai (optiska, elektriskā un magnētiskā) [53, 54]. Nukleīnskābju testēšanai uz mikrofluidiskajām platformām bieži tiek izmantoti nelieli parauga tilpumi (< 100 µl), tādēļ mērķa nukleīnskābju pastiprināšana ar īpašām zondēm, lai pārveidotu to signālā, kas ir ērts pakārtotai noteikšanai (optiska, elektriskā un magnētiskā) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Pārbaudot nukleīnskābes uz mikrofluidiskajām platformām, bieži tiek izmantoti nelieli parauga tilpumi (<100 µL), tāpēc ir nepieciešama mērķa nukleīnskābju pastiprināšana ar īpašām zondēm, lai tās pārvērstu signālā, kas ir ērts turpmākai noteikšanai (optiskā, elektriskā un magnētiskā). [53, 54].平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 便于 下游 检测 （光学 、 电学 和 磁学） 的 信号 信号 [53, 54 ].微流控 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Nukleīnskābju noteikšanai uz mikrofluidiskajām platformām parasti tiek izmantoti nelieli parauga tilpumi (<100 μl), kas prasa mērķa nukleīnskābju pastiprināšanu ar īpašām zondēm, lai tās pārvērstu signālos turpmākai noteikšanai (optiska, elektriskā un magnētiskā) [53, 54]] .Nukleīnskābju pastiprināšana mikrofluidikā var arī paātrināt reakcijas, optimizēt noteikšanas robežas, samazināt prasības pēc parauga un uzlabot noteikšanas precizitāti [55, 56].Pēdējos gados, realizējot ātru un precīzu noteikšanu, mikrofluidikā tiek izmantotas dažādas nukleīnskābju amplifikācijas metodes, tostarp PCR un dažas izotermiskās amplifikācijas reakcijas.Šajā sadaļā tiks apkopotas metodes nukleīnskābju noteikšanai, pamatojoties uz mikrofluidiskām sistēmām.
PCR ir organisma DNS replikācijas procesa simulācija, kuras teorija ir detalizēti aprakstīta citur un šeit netiks aplūkota.PCR var eksponenciālā ātrumā pastiprināt ļoti mazu mērķa DNS/RNS daudzumu, padarot PCR par spēcīgu instrumentu ātrai nukleīnskābju noteikšanai.Pēdējās desmitgadēs ir izstrādātas daudzas pārnēsājamas mikrofluidiskās ierīces, kas aprīkotas ar PCR termiskās cikla sistēmām, lai apmierinātu aprūpes punkta diagnostikas vajadzības [57, 58].Mikroshēmas PCR var iedalīt četros veidos (konvencionālā, nepārtrauktas plūsmas, telpiski pārslēgtā un konvektīvā PCR) pēc dažādām temperatūras kontroles metodēm [59].Piemēram, Gee et al.[60] izstrādāja tiešās reversās transkripcijas kvantitatīvās PCR (RT-qPCR) metodi savā mikrofluidiskajā platformā SARS-CoV-2, A un B gripas vīrusu multipleksai noteikšanai rīkles uztriepju paraugos (3.a attēls).Park et al.[61] izveidoja vienkāršu patogēnu analīzes mikroshēmu, integrējot plānslāņa PCR, elektrodus un ar pirkstu darbināmu polidimetilsiloksāna mikrofluidisko moduli.Tomēr abi darbi iemieso parastās PCR kopējos trūkumus.PCR nepieciešams termiskais cikls, kas ierobežo turpmāku ierīces miniaturizāciju un samazina testēšanas laiku.
Lai risinātu šo problēmu, ir ļoti svarīgi izstrādāt nepārtrauktu plūsmu balstītu mikrofluidisku un kosmosa PCR.Izmantojot garu serpentīna kanālu vai īsu taisnu kanālu, nepārtrauktas plūsmas PCR var nodrošināt ātru pastiprināšanu, aktīvi cirkulējot reaģentus trīs priekšsildīšanas zonās ar off-chip sūkni.Šī darbība sekmīgi ļauj izvairīties no pārejas fāzes starp dažādām reakcijas temperatūrām un tādējādi būtiski samazina testēšanas laiku [62] (3.b att.).Citā pētījumā, ko veica Jung et al.[63] ierosināja jaunu rotējošu PCR ģenētisko analizatoru, kas apvieno fiksētās un plūsmas PCR īpašības ultraātrās un multipleksās reversās transkripcijas PCR (3.c att.).Nukleīnskābju amplifikācijai PCR mikroshēma tiks pagriezta caur trim sildīšanas blokiem dažādās temperatūrās: 1. Denaturācijas bloks 94°C, 2. Atlaidināšanas bloks 58°C, 3. Izplešanās bloks 72°C.
PCR pielietojums mikrofluidikā.Shematisks dirRT-qPCR attēlojums uz mikrofluidiskās platformas (pielāgots no [60]).b Nepārtrauktas plūsmas PCR mikromasīva shematisks attēlojums, pamatojoties uz serpentīna kanālu (pielāgots no [62]).c Rotācijas PCR ģenētiskā analizatora shematisks attēlojums, kas sastāv no mikroshēmas, trim sildīšanas blokiem un pakāpju motora (pielāgots no [63]).d Termokonvekcijas PCR diagramma ar centrifugēšanu un iestatīšanu (pielāgots no [64]).DirRT-qPCR, tiešā kvantitatīvā reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakcija
Izmantojot kapilārus un cilpas vai pat plānas plāksnes, konvekcijas PCR var ātri pastiprināt nukleīnskābes ar dabisku brīvu termisko konvekciju, neizmantojot ārēju sūkni.Piemēram, cikliskā olefīna polimēra mikrofluidiskā platforma tika izstrādāta uz izgatavotas rotējošas sildīšanas stadijas, kas izmanto termisko ciklu ar centrifugēšanu PCR cilpas mikrokanālā [64] (3.d attēls).Reakcijas šķīdumu virza termiskā konvekcija, kas nepārtraukti apmainās ar augstu un zemu temperatūru mikrokanālā ar gredzenveida struktūru.Visu pastiprināšanas procesu var pabeigt 10 minūtēs ar noteikšanas robežu 70,5 pg/kanāls.
Kā gaidīts, ātrā PCR ir spēcīgs instruments pilnībā integrētām paraugu atbildes molekulārās diagnostikas un multipleksās analīzes sistēmām.Ātrā PCR ievērojami samazina SARS-CoV-2 noteikšanai nepieciešamo laiku, kas veicina efektīvu COVID-19 pandēmijas kontroli.
PCR ir nepieciešams sarežģīts termiskais cikleris, kas nav piemērots POCT.Pavisam nesen mikrofluidikai tika izmantotas izotermiskās amplifikācijas metodes, tostarp, bet neaprobežojoties ar LAMP, rekombināzes polimerāzes amplifikāciju (RPA) un amplifikāciju, kuras pamatā ir nukleīnskābju sekvences [65, 66, 67, 68].Izmantojot šīs metodes, nukleīnskābes tiek pastiprinātas nemainīgā temperatūrā, atvieglojot zemu izmaksu, ļoti jutīgu pārnēsājamu POCT ierīču izveidi molekulārajai diagnostikai.
Augstas caurlaidības mikrofluidikas LAMP testi ļauj vairākkārt noteikt infekcijas slimības [42, 69, 70, 71].Kombinācijā ar centrbēdzes mikrofluidisko sistēmu LAMP var vēl vairāk atvieglot nukleīnskābju noteikšanas automatizāciju [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip tika izstrādāts vairāku paralēlu baktēriju vizuālai noteikšanai, izmantojot LAMP [76] (4.a att.).Izmantojot optimizētu LAMP testā, fluorescences signāla un trokšņa attiecība bija aptuveni 5 reizes, un noteikšanas robeža sasniedza 7, 2 kopijas / μl genoma DNS. Turklāt, pamatojoties uz metodi, tika vizualizēti piecu parasto gremošanas baktēriju patogēnu, tostarp Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis un Vibrio parahaemolyticus, esamība <60 minūtēs. Turklāt, pamatojoties uz metodi, tika vizualizēti piecu parasto gremošanas baktēriju patogēnu, tostarp Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis un Vibrio parahaemolyticus, esamība <60 minūtēs.Turklāt, izmantojot šo metodi mazāk nekā 60 minūtēs, tika vizualizēta piecu parasto gremošanas trakta baktēriju patogēnu klātbūtne, tostarp Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis un Vibrio parahaemolyticus.， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPTurklāt, izmantojot šo metodi, mazāk nekā 60 minūšu laikā tika vizualizēta piecu izplatītu baktēriju kuņģa-zarnu trakta patogēnu klātbūtne, tostarp Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius un Vibrio parahaemolyticus.
LAMP priekšrocības mikrofluidikā cita starpā ietver ātru reakciju un miniaturizētu noteikšanu.Tomēr reakcijas temperatūras (apmēram 70 °C) dēļ LAMP laikā neizbēgami rodas aerosoli, kā rezultātā tiek iegūts augsts viltus pozitīvu rezultātu rādītājs.Testa specifika, primer dizains un temperatūras kontrole arī ir jāoptimizē LAMP.Turklāt mikroshēmu modeļi, kas vienā mikroshēmā ievieš vairāku mērķu noteikšanu, ir ļoti vērtīgi, un tie ir jāizstrādā.Turklāt LAMP ir piemērots daudzfunkcionālai noteikšanai, kas integrēta vienā mikroshēmā, kam ir liela nozīme, taču vēl ir daudz vietas attīstībai.
Augsto viltus pozitīvo LAMP ātrumu var daļēji samazināt ar RPA, jo salīdzinoši zemā reakcijas temperatūra (~37 °C) rada salīdzinoši maz iztvaikošanas problēmu [77].RPA sistēmā divi pretēji praimeri ierosina DNS sintēzi, saistoties ar rekombināzi, un amplifikācija var tikt pabeigta 10 minūšu laikā [78,79,80,81].Tāpēc viss RPA process ir daudz ātrāks nekā PCR vai LAMP.Pēdējos gados ir pierādīts, ka mikrofluidiskā tehnoloģija vēl vairāk uzlabo RPA ātrumu un precizitāti [82,83,84].Piemēram, Liu et al.[85] izstrādāja mikrofluidiski integrētu laterālās plūsmas polimerāzes rekombināzes amplifikācijas testu ātrai un jutīgai SARS-CoV-2 noteikšanai, integrējot reversās transkripcijas RPA (RT-RPA) un universālu sānu plūsmas testa strēmeles noteikšanas sistēmu.vienā mikrofluidiskā sistēmā.4.b attēls).Noteikšanas ierobežojums ir 1 kopija/µl vai 30 kopijas uz paraugu, un noteikšanu var pabeigt aptuveni 30 minūtēs.Kong et al.ir izstrādājuši valkājamu mikrofluidisko ierīci.[86] izmantoja ķermeņa temperatūru un mobilā tālruņa fluorescences noteikšanas sistēmu, lai ātri un tieši noteiktu HIV-1 DNS, izmantojot RPA (4.c attēls).Valkājams RPA tests nosaka 100 kopijas/ml mērķa secības 24 minūšu laikā, parādot lielu potenciālu ātrai HIV-1 inficētu zīdaiņu diagnostikai ierobežotos resursos.
Izotermiskā pastiprināšana aprūpes punktā (POCT).Spin un reakcijas SlipChip izstrāde un ražošana.Pēc plazmas metināšanas augšējās un apakšējās mikroshēmas tika saliktas ar uzgriežņu komplektu, lai izveidotu galīgo mikroshēmu (pielāgots no [76]).b MI-IF-RPA sistēmas shēma COVID-19 noteikšanai (pielāgota no [85]).c Valkājama RPA testa shēma ātrai HIV-1 DNS noteikšanai (pielāgots no [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksifluoresceīns, cilvēka imūndeficīta vīruss HIV, RPA rekombināzes polimerāzes amplifikācija, LED gaismas diode, MI-IF-RPA Rebinated La Microfluidics Pomerase Pomerase Pastiprināšana
Uz mikrofluīdiem balstīta RPA strauji attīstās, tomēr mikroshēmu ražošanas izmaksas un reakcijas patēriņš ir pārāk augstas, un tās ir jāsamazina, lai palielinātu šīs tehnoloģijas pieejamību.Turklāt RPA augstā jutība var ietekmēt nespecifisku produktu pastiprināšanos, īpaši piesārņojuma klātbūtnē.Šie ierobežojumi var ietekmēt RPA pielietojumu mikrofluidiskajās sistēmās un ir pelnījuši turpmāku optimizāciju.Ir nepieciešami arī labi izstrādāti primeri un zondes dažādiem mērķiem, lai uzlabotu uz RPA balstītu mikrofluidisko stratēģiju iespējamību POCT.
Cas13 un Cas12a ir iespēja nejauši šķelt nukleīnskābes, un tādējādi tos var izstrādāt kā noteikšanas un diagnostikas rīkus.Cas13 un Cas12a tiek aktivizēti, attiecīgi saistoties ar mērķa DNS vai RNS.Kad proteīns ir aktivizēts, tas sāk šķelt citas tuvumā esošās nukleīnskābes, pēc tam virzošās RNS, kas vērstas uz patogēniem specifiskām nukleīnskābēm, var sašķelt dzēstās fluorescējošās zondes un atbrīvot fluorescenci.Pamatojoties uz šo teoriju, Kellner et al.[87] izstrādāja uz Cas13 balstītu metodi [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], un Broughton et al.[88] izstrādāja citu pieeju, kuras pamatā ir Cas12a [CRISPR Trans Reporter, kas vērsts uz DNS endonukleāzi (DTECR)].
Pēdējos gados ir parādījušās dažādas nukleīnskābju noteikšanas metodes, kuru pamatā ir CRISPR [89, 90].Parastās CRISPR metodes bieži vien ir laikietilpīgas un darbietilpīgas, jo ir vairākas procedūras, tostarp nukleīnskābju ekstrakcija, pastiprināšana un CRISPR noteikšana.Šķidrumu pakļaušana gaisa iedarbībai var palielināt viltus pozitīvu rezultātu iespējamību.Ņemot vērā iepriekš minēto, uz CRISPR balstītām sistēmām ir ļoti nepieciešama optimizācija.
CRISPR-Cas12a un CRISPR-Cas13a noteikšanas lietojumprogrammām ir izstrādāta pneimatiski vadāma mikrofluidiskā platforma, kas var veikt 24 analīzes paralēli [91].Sistēma ir aprīkota ar fluorescences noteikšanas ierīci, kas apiet nukleīnskābju amplifikāciju un automātiski nosaka femtomolārus DNS un RNS paraugus.Chen et al.[92] integrēta rekombināzes amplifikācija ar CRISPR-Cas12a sistēmu centrbēdzes mikrofluidikā (5.a att.).Šis darbs pārvar grūtības integrēt šos divus procesus, jo Cas12a var sagremot messenger DNS un kavēt amplifikācijas procesu.Turklāt Chen et al.[92] papildus iepriekš uzglabāja reakcijas reaģentus centrbēdzes mikrofluidiskā kontrolē, lai automātiski pabeigtu visu procesu.Citā darbā Silva et al.[93] izstrādāja diagnostikas metodi bez CRISPR/Cas12a pastiprināšanas un viedtālruni SARS-CoV-2 noteikšanai (5.b att.).Šis tests, kas pazīstams kā mobilā tālruņa sistēma bez pastiprināšanas, ietver no CRISPR/Cas atkarīgu enzīmu, kura pamatā ir viedtālruņa katalāzes radīto burbuļu signālu vizualizācija mikrofluidiskajos kanālos.Jutīga noteikšana mazāk nekā 50 kopijām/µl nukleīnskābes bez iepriekšējas pastiprināšanas, viss process no parauga ievadīšanas līdz signāla nolasīšanai aizņem tikai 71 minūti.
Nukleīnskābju noteikšanas metodes, kuru pamatā ir CRISPR.Centrbēdzes POCT integrētai molekulārajai diagnostikai, kuras pamatā ir CRISPR (pielāgots no [92]).b CASCADE testa izstrāde SARS-CoV-2 viedtālruņu analīzei (pielāgots no [93]).RAA rekombināzes amplifikācija, PAM blakus esošais protospacer motīvs, CRISPR klasterēti īsi palindromiski atkārtojumi ar regulāriem intervāliem, CASCADE sistēma bez mobilā tālruņa pastiprināšanas ar CRISPR/CAS atkarīgiem enzīmiem, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimīda hidrohlorīds EDC
Kā pēdējais solis nukleīnskābju noteikšanā signālu noteikšana tieši atspoguļo diagnostikas rezultātus un ir kritisks faktors efektīvas, jutīgas un precīzas POCT izstrādē.Signālus var nolasīt, izmantojot dažādas metodes, piemēram, fluorescējošu, elektroķīmisko, kolorimetrisko un magnētisko stratēģiju.Šajā sadaļā mēs aprakstām katras pieejas pamatojumu un salīdzinām infekcijas slimību molekulāro diagnostiku mikrofluidikā.
Uz fluorescenci balstītas stratēģijas tiek plaši izmantotas infekcijas slimību POCT diagnostikā, pateicoties to ievērojamajām priekšrocībām, proti, lieliska jutība, zemas izmaksas, vienkārša darbība un aprūpes punktu analīze [94, 95].Šajās stratēģijās tiek izmantoti marķēti fluorofori, piemēram, fluorescējošas krāsvielas un nanomateriāli, lai izveidotu nosakāmu signālu (fluorescences uzlabošana vai slāpēšana).Šis atklājums liecina, ka uz fluorescenci balstītas stratēģijas var iedalīt tiešā fluorescējošā marķēšanā, signāla ieslēgšanas un signāla izslēgšanas fluorescējošā noteikšanā [96].Tiešā fluorescējošā marķējuma noteikšana izmanto īpašas fluorescējošas etiķetes, lai marķētu specifiskus ligandus, kas rada noteiktu fluorescences daudzumu, kad tie selektīvi saistās ar mērķi.Uz signālu balstītai fluorescences noteikšanai fluorescējošā signāla kvalitāte ir pozitīvi saistīta ar interesējošo lielumu.Fluorescences intensitāte ir niecīga, ja nav mērķa, un tā ir nosakāma, ja ir pietiekams mērķa daudzums.Un otrādi, fluorescences intensitāte, kas noteikta ar “signāla izslēgšanas” fluorescenci, ir apgriezti proporcionāla mērķa daudzumam, sākotnēji sasniedzot maksimālo vērtību un pakāpeniski samazinoties, palielinot mērķi.Piemēram, izmantojot CRISPR-Cas13a no mērķa atkarīgo trans-šķelšanās mehānismu, Tian et al.[97] izstrādāja jaunu atpazīšanas stratēģiju, lai noteiktu RNS, kas apiet reverso transkripciju tieši (6.a attēls).Saistoties ar komplementārām mērķa RNS, CRISPR-Cas13-RNS komplekss var tikt aktivizēts, izraisot transkolaterālo šķelšanos ar nespecifiskām reportieru RNS.Fluorescējoši marķētais reportieris [fluorofors (F)] tiek dzēsts ar dzesētāju (Q) neskartu un fluorescē, kad to sadala aktivētais komplekss.
Elektroķīmiskās noteikšanas priekšrocība ir liels noteikšanas ātrums, vienkārša ražošana, zemas izmaksas, viegli pārnēsājams un automātiska vadība.Tā ir spēcīga analītiskā metode POCT lietojumiem.Pamatojoties uz grafēna lauka efekta tranzistoriem Gao et al.[98] izstrādāja nanobiosensoru Laima slimības antigēnu multipleksai noteikšanai no Borrelia burgdorferi baktērijām ar noteikšanas robežu 2 pg/mL (6.b att.).
Kolorimetriskās pārbaudes ir izmantotas POCT lietojumos, gūstot labumu no pārnesamības, zemo izmaksu, vieglas sagatavošanas un vizuālās nolasīšanas priekšrocībām.Kolorimetriskā noteikšanā var izmantot peroksidāzes vai peroksidāzei līdzīgu nanomateriālu oksidēšanu, nanomateriālu agregāciju un indikatorkrāsu pievienošanu, lai informāciju par mērķa nukleīnskābju klātbūtni pārvērstu redzamās krāsu izmaiņās [99, 100, 101].Proti, zelta nanodaļiņas tiek plaši izmantotas kolorimetrisko stratēģiju izstrādē, un, ņemot vērā to spēju izraisīt straujas un nozīmīgas krāsu izmaiņas, pieaug interese par POCT kolorimetrisko platformu izstrādi infekcijas slimību in situ diagnostikai [102].Ar integrētu centrbēdzes mikrofluidisko ierīci [103] ar pārtiku pārnēsātos patogēnus piesārņotā piena paraugos var automātiski noteikt 10 baktēriju šūnu līmenī, un rezultātus var vizuāli nolasīt 65 minūšu laikā (6.c att.).
Magnētiskās noteikšanas metodes var precīzi noteikt analīti, izmantojot magnētiskos materiālus, un pēdējās desmitgadēs ir bijusi ievērojama interese par POCT lietojumiem.Magnētiskās noteikšanas metodēm ir dažas unikālas priekšrocības, piemēram, zemu izmaksu magnētiskie materiāli, nevis dārgi optiskie komponenti.Tomēr magnētiskā lauka izmantošana uzlabo noteikšanas efektivitāti un samazina parauga sagatavošanas laiku [104].Turklāt magnētiskās zondēšanas rezultāti liecina par augstu specifiskumu, jutīgumu un augstu signāla un trokšņa attiecību, jo bioloģisko paraugu magnētiskais fona signāls ir nenozīmīgs [105].Šarma et al.pārnēsājamā mikroshēmas platformā integrēja uz magnētiskā tuneļa savienojuma balstītu biosensoru.[106] patogēnu multipleksai noteikšanai (6.d att.).Biosensori jutīgi nosaka subnanomolāras nukleīnskābes, kas izolētas no patogēniem.
Tipiska signāla noteikšanas metode.Cas13a hiperlokalizētas noteikšanas jēdziens (pielāgots no [97]).b Grafēna nanobiosensors FET kombinācijā ar Laima GroES scFv (pielāgots no [98]).c Kolorimetriskās indikācijas pārtikas izraisītu patogēnu multipleksai noteikšanai centrbēdzes mikrofluidiskā mikroshēmā: Nr. 1 un Nr. 3 paraugi ar mērķa patogēniem un Nr. 2, Nr. 4 un Nr. 5 paraugi bez mērķa patogēniem (pielāgots no [103]) .d Biosensors, kas balstīts uz magnētiskā tuneļa krustojumu, ietverot platformu, iebūvētu bloķēšanas pastiprinātāju, vadības bloku un barošanas avotu signālu ģenerēšanai/iegūšanai (pielāgots no [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikons, PMMA polimetilmetakrilāts
Neskatoties uz iepriekš minēto noteikšanas metožu lieliskajām īpašībām, tām joprojām ir trūkumi.Šīs metodes ir salīdzinātas (1. tabula), iekļaujot dažas lietojumprogrammas ar detaļām (par un pret).
Attīstoties mikrofluidikai, mikroelektromehāniskajām sistēmām, nanotehnoloģijām un materiālu zinātnei, mikrofluidisko mikroshēmu izmantošana infekcijas slimību noteikšanai pastāvīgi attīstās [55,96,107,108].Precīza manipulācija ar miniatūrām iekārtām un šķidrumiem veicina diagnostikas precizitāti un izmaksu efektivitāti.Tāpēc turpmākai attīstībai ir pieliktas pūles mikroshēmu optimizēšanai un modernizācijai, kā rezultātā ir iegūtas dažādas mikrofluidiskās mikroshēmas ar atšķirīgu struktūru un funkcijām.Šeit mēs īsumā iepazīstinām ar vairākiem izplatītiem mikrofluidisko platformu veidiem un salīdzinām to īpašības (plusus un mīnusus).Turklāt lielākā daļa tālāk uzskaitīto piemēru galvenokārt ir vērsti uz SARS-CoV-2 apkarošanu.
LOCC ir visizplatītākās miniaturizētās kompleksās analītiskās sistēmas, un to darbības ir ļoti miniaturizētas, integrētas, automatizētas un paralēlas, sākot no parauga ievadīšanas un sagatavošanas, plūsmas kontroles un šķidruma noteikšanas [109, 110].Šķidrumi tiek manipulēti, izmantojot rūpīgi izstrādātu ģeometriju un daudzu fizisku efektu, piemēram, spiediena gradientu, kapilāru darbību, elektrodinamikas, magnētisko lauku un akustisko viļņu mijiedarbību [111].LOCC parāda lieliskas priekšrocības augstas caurlaidības skrīningā un daudzkārtējā noteikšanā, ar lielu analīzes ātrumu, mazu parauga lielumu, zemu enerģijas patēriņu un augstu pārvaldības un darbības efektivitāti;tomēr LOCC ierīces ir ļoti delikātas, to ražošana, iepakošana un saskarne.Tomēr multipleksēšana un atkārtota izmantošana saskaras ar milzīgām grūtībām [96].Salīdzinot ar citām platformām, LOCC ir unikālas priekšrocības attiecībā uz maksimālo pielietojumu daudzveidību un labāko tehnoloģiju savietojamību, taču arī tās trūkumi ir acīmredzami, proti, augstā sarežģītība un slikta atkārtojamība.Atkarība no ārējiem sūkņiem, kas bieži ir apjomīgi un dārgi, vēl vairāk ierobežo to izmantošanu POCT.
COVID-19 uzliesmojuma laikā LOCC saņēma lielu uzmanību.Tajā pašā laikā ir vairākas jaunas mikroshēmas, kas apvieno vairākas tehnoloģijas.Piemēram, viedtālruņus tagad plaši izmanto kā pārnēsājamas analītikas ierīces, un tiem ir liels LOCC integrācijas potenciāls.Sun et al.[21] izgatavoja mikrofluidisku mikroshēmu, kas ļauj multipleksēt piecu patogēnu, tostarp SARS-CoV-2, specifiskas nukleīnskābju sekvences, izmantojot LAMP, un analizēja tās, izmantojot viedtālruni 1 stundas laikā pēc reakcijas beigām.Kā vēl viens piemērs, Sundah et al.[112] izveidoja molekulāro slēdzi [katalītiskā pastiprināšana ar molekulārās pārejas stāvokļa slēdzi (CATCH)] SARS-CoV-2 RNS mērķu tiešai un jutīgai noteikšanai, izmantojot viedtālruņus. CATCH ir saderīgs ar portatīvo LOCC un nodrošina izcilu veiktspēju (apmēram 8 RNS kopijas/μl; < 1 h istabas temperatūrā) [112]. CATCH ir saderīgs ar portatīvo LOCC un nodrošina izcilu veiktspēju (apmēram 8 RNS kopijas/μl; < 1 h istabas temperatūrā) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность [примерно]. CATCH ir savietojams ar portatīvo LOCC un nodrošina lielisku caurlaidspēju (apmēram 8 RNS kopijas/µl; < 1 h istabas temperatūrā) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀[112]） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀[112]） CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкри; трай 1.2.1. РНК/мкри); CATCH ir saderīgs ar pārnēsājamiem LOCC, un tam ir lieliska veiktspēja (apmēram 8 RNS kopijas/µl; < 1 stunda istabas temperatūrā) [112].Turklāt LOCC ierīces molekulārajai diagnostikai izmanto arī dažus virzošos spēkus, piemēram, vakuumu, stiepšanos un elektriskos laukus.Kang et al.[113] demonstrēja reāllaika, īpaši ātru nanoplazmas mikroshēmas PCR, lai ātri un kvantitatīvi diagnosticētu COVID-19 uz lauka, izmantojot vakuuma plazmonisko šķidro PCR mikroshēmu.Li et al.[114] pēc tam izstrādāja stiepes vadītu mikrofluidisko mikroshēmu, kas ļāva diagnosticēt COVID-19.Platforma izmanto RT-LAMP pastiprināšanas sistēmu, lai noteiktu, vai paraugs ir kvalitatīvi pozitīvs vai negatīvs.Pēc tam Ramachandran et al.[115] panāca atbilstošus elektriskā lauka gradientus, izmantojot izotachoforēzi (ITP), selektīvās jonu fokusēšanas paņēmienu, kas ieviests mikrofluidikā.Izmantojot ITP, mērķa RNS no neapstrādātiem nazofaringijas uztriepju paraugiem var tikt automātiski attīrīta.Tad Ramachandran et al.[115] Apvienojot šo ITP attīrīšanu ar ITP uzlabotajiem LAMP un CRISPR testiem, SARS-CoV-2 tika atklāts cilvēka nazofaringijas uztriepes un klīniskajos paraugos aptuveni 35 minūtēs.Turklāt nemitīgi rodas jaunas idejas.Jadhavs et al.[116] ierosināja diagnostikas shēmu, kas balstīta uz virsmas uzlaboto Ramana spektroskopiju kombinācijā ar mikrofluidisku ierīci, kas satur vai nu vertikāli orientētas ar zeltu/sudrabu pārklātas oglekļa nanocaurules, vai vienreizējās lietošanas elektrovērptas mikro/nanocaurules.Ar membrānu funkcionalizēti iebūvētie filtru mikrokanāli ir vienreizlietojami.Ierīce adsorbē vīrusus no dažādiem ķermeņa šķidrumiem/izdalījumiem, piemēram, siekalām, nazofarneksu un asarām.Tādējādi vīrusa titrs ir bagātīgs, un vīrusu var precīzi identificēt pēc Ramana paraksta.
LOAD ir centrbēdzes mikrofluidiska platforma, kurā visus procesus kontrolē frekvences protokols, kas rotē mikrostrukturētu substrātu [110].LOAD ierīci raksturo centrbēdzes spēka izmantošana kā svarīgs dzinējspēks.Šķidrumi ir pakļauti arī kapilāru, Eilera un Koriolisa spēkiem.Izmantojot centrifūgas ierīci, analīzes tiek veiktas nepārtrauktā šķidruma režīmā no radiālas iekšpuses uz āru, tādējādi novēršot nepieciešamību pēc papildu ārējām caurulēm, sūkņiem, izpildmehānismiem un aktīviem vārstiem.Īsāk sakot, viena kontroles metode vienkāršo darbību.Spēki, kas iedarbojas uz šķidrumu tajā pašā mikrofluidiskajā kanālā vienādā attālumā no slodzes centra, ir vienādi, kas ļauj atkārtot kanāla struktūru.Tādējādi LOAD iekārtas ir vienkāršākas un ekonomiskākas projektēšanā un ražošanā nekā parastās LOCC iekārtas, savukārt reakcijas lielā mērā ir neatkarīgas un paralēlas;tomēr centrbēdzes iekārtu augstās mehāniskās izturības dēļ pieejamais skaidu materiāls ir ierobežots un mazi apjomi ir sarežģīti.uz mašīnu.Tajā pašā laikā lielākā daļa LOAD ierīču ir paredzētas tikai vienreizējai lietošanai, kas ir dārga liela mēroga noteikšanai [96, 117, 118, 119].
Pēdējās desmitgadēs LOAD, kas tiek uzskatīta par vienu no daudzsološākajām mikrofluidiskajām ierīcēm, ir saņēmusi ievērojamu pētnieku un ražotāju uzmanību.Tādējādi LOAD ir guvis plašu atzinību un izmantots infekcijas patogēnu [120, 121, 122, 123, 124] molekulārajai diagnostikai, īpaši COVID-19 uzliesmojuma laikā.Piemēram, 2020. gada beigās Ji et al.[60] demonstrēja tiešu RT-qPCR testu ātrai un automatizētai SARS-CoV-2 un A un B gripas infekciju paralēlai noteikšanai rīkles uztriepju paraugos.Tad Xiong et al.[74] iepazīstināja ar LAMP integrētu diskveida mikrofluidisko platformu ātrai, precīzai un vienlaicīgai septiņu cilvēka elpceļu koronavīrusu, tostarp SARS-CoV-2, noteikšanai 40 minūšu laikā.2021. gada sākumā de Oliveira u.c.[73] demonstrēja polistirola tonera centrbēdzes mikrofluidisko mikroshēmu, kas tika manuāli darbināta ar pirkstu rotatoru, lai veiktu COVID-19 molekulāro diagnostiku RT-LAMP.Pēc tam Dignan et al.[39] iepazīstināja ar automatizētu pārnēsājamu centrifūgas mikroierīci SARS-CoV-2 RNS attīrīšanai tieši no vaiga uztriepju sekcijām.Medved et al.[53] ierosināja iebūvētu SARS-CoV-2 aerosola paraugu ņemšanas sistēmu ar neliela tilpuma rotējošu mikrofluidiski fluorescējošu mikroshēmu ar noteikšanas robežu 10 kopijas/μL un minimālo cikla slieksni 15 minūtes.Suarez et al.[75] nesen ziņoja par integrētas modulāras centrbēdzes mikrofluidiskas platformas izstrādi SARS-CoV-2 RNS tiešai noteikšanai termiski inaktivētos nazofaringeālos uztriepes paraugos, izmantojot LAMP.Šie piemēri parāda LOAD lielos ieguvumus un solījumus COVID-19 molekulārajā diagnostikā.
1945. gadā Mullers un Klegs [125] pirmo reizi prezentēja mikrofluidiskos kanālus uz papīra, izmantojot filtrpapīru un parafīnu.2007. gadā Whitesides grupa [126] izveidoja pirmo funkcionālā papīra platformu olbaltumvielu un glikozes testēšanai.Papīrs ir kļuvis par ideālu substrātu mikrofluidikai.Papīram ir raksturīgas īpašības, piemēram, hidrofilitāte un poraina struktūra, lieliska bioloģiskā saderība, viegls svars, elastība, salokāmība, zemas izmaksas, lietošanas vienkāršība un ērtības.Klasiskie µPAD sastāv no hidrofilām/hidrofobām struktūrām, kas veidotas uz papīra substrātiem.Atkarībā no trīsdimensiju struktūras μPAD var iedalīt divdimensiju (2D) un trīsdimensiju (3D) μPAD.2D µPAD tiek ražoti, veidojot hidrofobas robežas, veidojot mikrofluidiskos kanālus, savukārt 3D µPAD parasti izgatavo no 2D mikrofluidiska papīra slāņu kaudzēm, dažreiz izmantojot papīra locīšanu, slīdēšanas metodes, atvērtus kanālus un 3D drukāšanu [96].Ūdens vai bioloģiskie šķidrumi uz μPAD galvenokārt tiek kontrolēti ar kapilāru spēku bez ārēja barošanas avota, atvieglojot reaģentu iepriekšēju uzglabāšanu, paraugu apstrādi un multipleksu noteikšanu.Tomēr precīzu plūsmas kontroli un multipleksu noteikšanu apgrūtina nepietiekams noteikšanas ātrums, jutība un atkārtota izmantošana [96, 127, 128, 129, 130].
Kā neparasta mikrofluidiskā platforma μPAD ir plaši reklamēts un izstrādāts tādu infekcijas slimību kā HCV, HIV un SARS-CoV-2 molekulārajai diagnostikai [131, 132].Selektīvai un jutīgai HCV noteikšanai Tengam et al.[133] izstrādāja jaunu biosensoru, kura pamatā ir fluorescējošs papīrs, izmantojot ļoti specifisku nukleīnskābes zondi, kuras pamatā ir pirolidinilpeptīds.Nukleīnskābes tiek kovalenti imobilizētas uz daļēji oksidēta celulozes papīra, veicot reducējošu alkilēšanu starp aminogrupām un aldehīdu grupām, un noteikšana balstās uz fluorescenci.Šos signālus var nolasīt speciāli izgatavots sīkrīks ar pārnēsājamu dienasgaismas kameru kombinācijā ar mobilā tālruņa kameru.Pēc tam Lu et al.[134] izstrādāja uz papīra balstītu elastīgu elektrodu, kura pamatā ir niķeļa/zelta nanodaļiņas/oglekļa nanocaurules/polivinilspirta organometāliskā karkasa kompozīti HIV mērķa noteikšanai ar DNS hibridizāciju, izmantojot metilēnzilu kā DNS redoks indikatoru.Pavisam nesen Chowdury et al.[135] iepazīstināja ar hipotētisku platformas dizainu µPAD testēšanai aprūpes vietā, izmantojot neapstrādātas pacienta siekalas kombinācijā ar LAMP un portatīvo attēlveidošanas tehnoloģiju COVID-19 analīta noteikšanai.
Sānu plūsmas testi vada šķidrumus ar kapilāru spēku palīdzību un kontrolē šķidruma kustību, ņemot vērā porainu vai mikrostrukturētu substrātu mitrināmību un īpašības.Sānu plūsmas ierīces sastāv no parauga, konjugāta, inkubatora un noteikšanas, un absorbējošiem spilventiņiem.LFA esošās nukleīnskābes molekulas atpazīst specifiskas saistvielas, kas ir iepriekš saglabātas saistīšanās vietā un saistās kā kompleksi.Šķidrumam ejot cauri inkubācijas un noteikšanas plāksnēm, kompleksus uztver uztveršanas molekulas, kas atrodas uz testa un kontroles līnijām, parādot rezultātus, ko var nolasīt tieši ar neapbruņotu aci.Parasti LFA var pabeigt 2–15 minūtēs, kas ir ātrāk nekā tradicionālā atklāšana.Speciālā mehānisma dēļ LFA prasa maz darbību un neprasa papildu aprīkojumu, kas padara to ļoti lietotājam draudzīgu.To ir viegli ražot un miniaturizēt, un papīra substrātu izmaksas ir zemākas.Tomēr to izmanto tikai kvalitatīvai analīzei, un kvantitatīvā noteikšana ir ļoti sarežģīta, un multipleksēšanas spēja un caurlaidspēja ir ļoti ierobežota, un vienlaikus var noteikt tikai vienu pietiekamu nukleīnskābi [96, 110, 127].
Lai gan lielākā daļa LFA lietojumu ir vērsti uz imūntestiem, efektīva un populāra ir arī LFA izmantošana molekulārajai diagnostikai mikrofluidiskajās mikroshēmās [136].B hepatīta vīrusa gadījumā HIV un SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] ierosināja paaugstinātas konversijas nanodaļiņu LFA platformu un demonstrēja šīs miniaturizētās un pārnēsājamās platformas daudzpusību, jutīgi un kvantitatīvi nosakot vairākus mērķus, piemēram, HBV nukleīnskābi.Turklāt Fu et al.[138] demonstrēja jaunu LFA, kas balstīta uz virsmas uzlaboto Ramana spektroskopiju HIV-1 DNS kvantitatīvai analīzei zemās koncentrācijās.Ātrai un jutīgai SARS-CoV-2 noteikšanai Liu et al.[85] izstrādāja mikrofluidiski integrētu RPA sānu plūsmas analīzi, apvienojot RT-RPA un universālu sānu plūsmas noteikšanas sistēmu vienā mikrofluidiskā sistēmā.
Dažādu mikrofluidisko platformu pielietojums atšķiras atkarībā no konkrētiem pētījumiem, pilnībā izmantojot platformu iespējas un priekšrocības.Ar pieejamiem vārstiem, sūkņiem un kanāliem LOCC ir visplašākā platforma lietojumu daudzveidībai un savietojamībai ar vislielāko attīstības telpu.Tāpēc mēs ceram un iesakām LOCC kā pirmo mēģinājumu veikt jaunākos pētījumus un optimizēt apstākļus.Turklāt sagaidāms, ka sistēmā tiks atklātas un izmantotas efektīvākas un precīzākas metodes.LOAD izceļas ar precīzu šķidrumu kontroli no esošajām LOCC ierīcēm un demonstrē unikālas priekšrocības atsevišķiem diskdziņiem ar centrbēdzes spēku bez nepieciešamības pēc ārējiem diskdziņiem, savukārt paralēlās reakcijas var būt atsevišķas un sinhronizētas.Tādējādi nākotnē LOAD kļūs par galveno mikrofluidisko platformu ar mazākām manuālām darbībām un nobriedušākām un automatizētākām tehnoloģijām.µPAD platforma apvieno LOCC un papīra materiālu priekšrocības zemu izmaksu vienreizējai diagnostikai.Tāpēc turpmākajā attīstībā jākoncentrējas uz ērtām un vispāratzītām tehnoloģijām.Turklāt LFA ir labi piemērota neapbruņotu acu noteikšanai, solot samazināt paraugu patēriņu un paātrināt noteikšanu.Detalizēts platformu salīdzinājums ir parādīts 2. tabulā.
Digitālās analīzes sadala paraugu daudzos mikroreaktoros, no kuriem katrs satur noteiktu skaitu mērķa molekulu [139, 140].Digitālie testi piedāvā ievērojamas priekšrocības absolūtā kvantitatīvā noteikšanā, veicot tūkstošiem paralēlu bioķīmisko eksperimentu vienlaicīgi un atsevišķi mikronu mēroga nodalījumos, nevis nepārtrauktā fāzē.Salīdzinot ar tradicionālajām mikrofluidikām, nodalījumu reakcijas var samazināt parauga tilpumu, palielināt reakcijas efektivitāti un viegli integrēt ar citām analītiskajām metodēm, neizmantojot kanālus, sūkņus, vārstus un kompaktas konstrukcijas [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Digitālajos testos tiek izmantotas šādas divas metodes, lai panāktu vienmērīgu un precīzu šķīdumu, tostarp reaģentu un paraugu, piemēram, šūnu, nukleīnskābju un citu daļiņu vai molekulu atdalīšanu: (1) pilienu emulsijas, kas izmanto šķidruma saskarnes nestabilitāti;(2) masīvu dalīšanu veic, pamatojoties uz ierīces ģeometriskiem ierobežojumiem.Pirmajā metodē pilienus, kas satur reaģentus un paraugus mikrokanālos, var izveidot ar pasīvām metodēm, piemēram, līdzstrāvu, šķērsplūsmu, plūsmas fokusēšanu, pakāpenisku emulgāciju, mikrokanālu emulgāciju un membrānām, izmantojot viskozu bīdes spēkus un emulģēšanu ar kanālu maiņu.lokalizāciju [143, 145, 146, 148, 149] vai izmantojot aktīvās metodes [150, 151], kas ievada papildu enerģiju, izmantojot elektrisko, magnētisko, termisko un mehānisko vadību.Pēdējā pieejā vislabākā šķidruma tilpuma vienveidība mikrofluidiskajās kamerās tiek dalīta, saglabājot tāda paša izmēra telpiskās struktūras, piemēram, mikrobedres un virsmas blokus [152, 153, 154].Konkrēti, pilieni ir galvenās plūsmas sekcijas, kuras var arī ģenerēt un manipulēt ar elektrodu blokiem, kuru pamatā ir digitālā mikrofluidika (DMF).Dielektriķu elektromitināšana ir viena no vislabāk pētītajām DMF teorijām, jo dielektriķu elektromitrināšana ļauj precīzi manipulēt ar atsevišķiem pilieniem, kontrolējot šķidruma formu un asimetriskos elektriskos signālus, kas iet cauri dažādām pusēm [141, 144].Galvenās darbības ar pilieniņām DMF ietver šķirošanu, sadalīšanu un sapludināšanu [151, 155, 156], ko var izmantot dažādās analīzes jomās, īpaši molekulārajā noteikšanā [157, 158, 159].
Digitālā nukleīnskābju noteikšana ir trešās paaudzes molekulārās diagnostikas tehnoloģija pēc parastās PCR un kvantitatīvās reālā laika PCR (qPCR), paralēli augstas caurlaidības sekvencēšanai un šķidruma biopsijai.Pēdējās divās desmitgadēs digitālās nukleīnskābes ir strauji attīstījušās infekcijas patogēnu molekulārās diagnostikas jomā [160, 161, 162].Digitālās nukleīnskābju noteikšanas absolūtā kvantitatīva noteikšana sākas ar paraugu un reaģentu iepakošanu atsevišķos nodalījumos, lai nodrošinātu, ka katrai mērķa secībai ir vienāda iespēja iekļūt katrā atsevišķā nodalījumā.Teorētiski katrai sadaļai var piešķirt vairākas mērķa sekvences, vai arī var nebūt neatkarīgas mikroreakcijas sistēmas.Izmantojot dažādus iepriekš aprakstītos sensoru mehānismus, nodalījumus ar mikrobu mērķa sekvencēm, kas ģenerē signālus virs noteikta sliekšņa, var vizualizēt ar neapbruņotu aci vai ar mašīnu un apzīmēt kā pozitīvus, savukārt citus nodalījumus, kas ģenerē signālus zem sliekšņa, var apzīmēt kā pozitīvus. .negatīvie, kas katras sadaļas signālu padara par Būla vērtību.Tādējādi, aprēķinot izveidoto nodalījumu skaitu un pozitīvo rezultātu ātrumu pēc reakcijas, testa paraugu oriģinālās kopijas var saskaņot, izmantojot Puasona sadalījuma formulu, neizmantojot standarta līkni, kas nepieciešama ikdienas kvantitatīvajām analīzēm, piemēram, kā qPCR.[163] Salīdzinājumā ar tradicionālajām molekulārās diagnostikas metodēm digitālajai nukleīnskābju noteikšanai ir augstāka automatizācijas pakāpe, lielāks analīzes ātrums un jutība, mazāk reaģentu, mazāk piesārņojuma un vienkāršāka konstrukcija un izgatavošana.Šo iemeslu dēļ SARS-CoV-2 kritiskā uzliesmojuma laikā ir labi pētīta digitālo testu, jo īpaši uz pilienu balstītu metožu, izmantošana molekulārajai diagnostikai, apvienojot pastiprināšanas un signāla nolasīšanas metodes.Piemēram, Yin et al.[164] apvienoja pilienu digitālās un ātrās PCR metodes, lai mikrofluidiskā mikroshēmā noteiktu SARS-CoV-2 ORF1ab, N un RNase P gēnus.Konkrēti, sistēma spēja identificēt pozitīvu signālu 115 sekunžu laikā, kas ir ātrāk nekā parastā PCR, norādot uz tās efektivitāti aprūpes punkta noteikšanā (7.a attēls).Dongs et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] un Alteri et al.[167] izmantoja arī pilienu digitālo PCR (ddPCR), lai atklātu SARS-CoV-2 mikrofluidiskā sistēmā ar iespaidīgiem rezultātiem.Lai vēl vairāk uzlabotu noteikšanas ātrumu, Shen et al.[168] panāca uz ddPCR balstītu mikroshēmu attēlveidošanu tikai 15 sekundēs, neizmantojot attēlu sašūšanas metodes, paātrinot ddPCR tehnoloģijas procesu no laboratorijas līdz lietojumprogrammai.Tiek izmantotas ne tikai termiskās amplifikācijas metodes, piemēram, PCR, bet arī izotermiskās amplifikācijas metodes, lai vienkāršotu reakcijas apstākļus un ātru reakciju.Lu et al.[71] izstrādāja SlipChip pilienu analīzei, kas vienā solī spēj ģenerēt dažāda lieluma pilienus ar lielu blīvumu un kvantitatīvi noteikt SARS-CoV-2 nukleīnskābes, izmantojot digitālo LAMP (7.b attēls).Kā strauji attīstoša tehnoloģija CRISPR var arī spēlēt nozīmīgu lomu digitālajā nukleīnskābju noteikšanā, izmantojot ērtu kolorimetrisko attēlveidošanu bez papildu nukleīnskābju traipiem.Ackerman et al.izstrādāja kombinatorisku matricas reakciju nukleīnskābju multipleksai novērtēšanai.[158] mikroiedobes testā atklāja 169 ar cilvēku saistītus vīrusus, tostarp SARS-CoV-2, pilienos, kas satur uz CRISPR-Cas13 balstītus nukleīnskābju noteikšanas reaģentus (7.c attēls).Turklāt izotermisko pastiprināšanu un CRISPR tehnoloģiju var izmantot vienā sistēmā, lai apvienotu abu priekšrocības.Park et al.[169] CRISPR/Cas12a digitālais tests tika izstrādāts komerciālā mikrofluidiskā mikroshēmā, lai noteiktu ekstrahētu un karstuma izraisītu SARS-CoV-2, pamatojoties uz vienpakāpes RT-RPA ar īsāku un augstāku signāla-fona noteikšanu. laika attiecība., plašāks dinamiskais diapazons un labāka jutība (7.d att.).Daži šo piemēru apraksti ir sniegti 3. tabulā.
Tipiska digitālā platforma nukleīnskābju noteikšanai.a Ātrā digitālā PCR darbplūsma sastāv no četriem galvenajiem posmiem: parauga sagatavošana, reakcijas maisījuma sadale, amplifikācijas process un mērķa kvantitatīva noteikšana (pielāgots no [164]).b Shēma, kurā parādīta SlipChip pilienu analīze pilienu veidošanai pie augsta blīvuma (pielāgots no [71]).c CARMEN-Cas darbplūsmas diagramma13 (pielāgots no [158]).d Pārskats par uzlabotu digitālo vīrusu noteikšanu ar CRISPR/Cas vienā katlā (pielāgots no [169]).W/O ūdens eļļā, polidimetilsiloksāna PDMS, PCR polimerāzes ķēdes reakcija, DAQ datu vākšana, PID proporcionālais integrālais atvasinājums, CARMEN kombinatoriskās matricas reakcija multipleksai nukleīnskābju novērtēšanai, SARS-CoV-2, smags akūts respiratorais sindroms, koronavīruss 2, RT Reversās transkriptāzes rekombināzes polimerāzes-RPA pastiprināšana, S/B signāls fonā
Izlikšanas laiks: 15. septembris 2022
