Jaunumi

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Enzīmu tuvuma marķēšanas metodes, kuru pamatā ir aktivēti esteri vai fenoksi radikāļi, tiek plaši izmantotas subcelulāro proteomu un proteīnu mijiedarbības kartēšanai dzīvās šūnās.Tomēr aktivētie esteri ir mazāk reaģējoši, kā rezultātā ir plašs marķēšanas rādiuss, un fenoksi radikāļi, kas rodas, apstrādājot ar peroksīdu, var traucēt redoksu ceļus.Šeit mēs ziņojam par tuvuma marķēšanas atkarīgās fotoaktivācijas (PDPL) metodi, kas izstrādāta, ģenētiski saistot miniSOG fotosensibilizatora proteīnu ar interesējošo proteīnu.Zilās gaismas iedarbināts un ekspozīcijas laika kontrolēts, tiek ģenerēts vienots skābeklis, un pēc tam tiek panākta histidīna atlieku telpiski izšķirta marķēšana ar anilīna zondi.Mēs demonstrējam tā augsto precizitāti, izmantojot organellu specifisko proteomu kartēšanu.PDPL salīdzinājums ar TurboID parāda specifiskāku un visaptverošāku PDPL proteomisko pārklājumu.Pēc tam mēs izmantojām PDPL ar slimību saistītajam transkripcijas koaktivatoram BRD4 un E3 Parkin ligasei un atradām iepriekš nezināmus mijiedarbības faktorus.Veicot pārmērīgas ekspresijas skrīningu, Parkinam tika identificēti divi nezināmi substrāti, Ssu72 un SNW1, kuru degradāciju veicina ubikvitinācijas-proteasomu ceļš.
Precīzs olbaltumvielu tīklu raksturojums ir daudzu fundamentālu šūnu procesu pamatā.Tāpēc ļoti precīza proteīnu mijiedarbības spatiotemporālā kartēšana nodrošinās molekulāro pamatu bioloģisko ceļu, slimību patoloģijas atšifrēšanai un šo mijiedarbību izjaukšanai terapeitiskos nolūkos.Šim nolūkam ir ļoti vēlamas metodes, kas spēj noteikt īslaicīgu mijiedarbību dzīvās šūnās vai audos.Afinitātes attīrīšanas masas spektrometrija (AP-MS) vēsturiski ir izmantota, lai identificētu interesējošo proteīnu (POI) saistošos partnerus.Attīstoties kvantitatīvās proteomikas metodēm, tika izveidota Bioplex3.0, lielākā olbaltumvielu tīklu datubāze, kuras pamatā ir AP-MS.Lai gan AP-MS ir ļoti spēcīgs, šūnu līzes un atšķaidīšanas soļi darbplūsmā ir novirzīti uz vāju un pārejošu saistīšanās mijiedarbību un ievieš pēclīzes artefaktus, piemēram, viltotus mijiedarbības pārus, kuriem pirms līzes nav nodalījumu.
Lai risinātu šīs problēmas, ir izstrādātas nedabiskas aminoskābes (UAA) ar šķērssaistošām grupām un enzīmu tuvumā esošās marķēšanas (PL) platformas (piemēram, APEX un BioID)5.Lai gan UAA metode ir veiksmīgi izmantota daudzos scenārijos un sniedz informāciju par tiešajām proteīnu līmēm, joprojām ir nepieciešama UAA ievietošanas vietas optimizācija.Vēl svarīgāk ir tas, ka tā ir stehiometriskā marķēšanas metode, kurai trūkst marķēšanas notikumu katalītiskas maiņas.Turpretim fermentatīvās PL metodes, piemēram, BioID metode, sapludina inženierijas biotīna ligāzi ar POI7, kas pēc tam aktivizē biotīnu, veidojot reaktīvu biotinil-AMP estera starpproduktu.Tādējādi ferments katalizē un atbrīvo aktivētu biotīna "mākoni", kas iezīmē proksimālos lizīna atlikumus.Tomēr BioID prasa vairāk nekā 12 stundas, lai iegūtu pietiekamu marķētu signālu, kas neļauj to izmantot ar laika izšķirtspēju.Izmantojot virzītu evolūciju, kuras pamatā ir rauga displejs, TurboID tika izstrādāts, pamatojoties uz BioID, lai tas būtu efektīvāks, ļaujot efektīvi marķēt ar biotīnu 10 minūšu laikā, ļaujot pētīt dinamiskākus procesus.Tā kā TurboID ir ļoti aktīvs un endogēnais biotīna līmenis ir pietiekams zema līmeņa marķēšanai, fona marķēšana kļūst par potenciālu problēmu, ja ir nepieciešama ļoti uzlabota un noteikta laika marķēšana, pievienojot eksogēnu biotīnu.Turklāt aktivētie esteri ir vāji reaģējoši (t1/2 ~ 5 min), kas var izraisīt lielu marķējuma rādiusu, īpaši pēc blakus esošo proteīnu piesātinājuma ar biotīnu 5. Citā pieejā inženierijas ceļā iegūtas askorbāta peroksidāzes (ti, biotīna-peroksidāzes) ģenētiskā saplūšana. fenola radikāļus un ļauj marķēt olbaltumvielas vienas minūtes laikā9,10.APEX tiek plaši izmantots, lai identificētu subcelulāros proteomus, membrānas proteīnu kompleksus un citozola signālproteīnu kompleksus11,12.Tomēr nepieciešamība pēc augstas koncentrācijas peroksīdiem var ietekmēt redoksproteīnus vai ceļus, izjaucot šūnu procesi.
Tādējādi jauna metode, kas spēj radīt reaktīvākas marķētā rādiusa slāpēšanas sugas ar augstu telpisko un laika precizitāti, būtiski neizjaucot šūnu ceļus, būs nozīmīgs papildinājums esošajām metodēm. Starp reaktīvajām sugām mūsu uzmanību pievērsa singleta skābeklis, pateicoties tā īsajam kalpošanas laikam un ierobežotam difūzijas rādiusam (t1/2 < 0,6 µs šūnās)13. Starp reaktīvajām sugām mūsu uzmanību pievērsa singleta skābeklis, pateicoties tā īsajam kalpošanas laikam un ierobežotam difūzijas rādiusam (t1/2 < 0,6 µs šūnās)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ормен 3 Starp aktīvajām formām mūsu uzmanību piesaistīja singleta skābeklis, pateicoties tā īsajam kalpošanas laikam un ierobežotam difūzijas rādiusam (t1/2 < 0,6 µs šūnās)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2揨京傉䈕耵s！ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого 2.2.0.2.0. Starp aktīvajām formām mūsu uzmanību piesaista singletais skābeklis, jo ir īss kalpošanas laiks un ierobežots difūzijas rādiuss (t1/2 < 0,6 μs šūnās).Ir ziņots, ka vienotais skābeklis nejauši oksidē metionīnu, tirozīnu, histidīnu un triptofānu, padarot to par polāru 14, 15, lai pievienotu zondēm, kuru pamatā ir amīns vai tiols 16, 17 .Lai gan subcelulārā nodalījuma RNS marķēšanai ir izmantots singlets skābeklis, endogēno POI tuvuma marķieru atkārtotas izmantošanas stratēģijas joprojām nav izpētītas.Šeit mēs piedāvājam platformu, ko sauc par fotoaktivācijas atkarīgo tuvuma marķēšanu (PDPL), kurā mēs izmantojam zilu gaismu, lai apgaismotu POI, kas sakausēti ar miniSOG fotosensibilizatoru, un aktivizētu vienota skābekļa veidošanos, lai oksidētu proksimālos atlikumus, kam seko amīnu saturošas modifikācijas, lai oksidētu ķīmiskās zondes. starpposma dzīvās šūnas..Mēs pārbaudījām ķīmisko zondu grupu, lai maksimāli palielinātu tagu specifiku, un identificējām modifikācijas vietas, izmantojot atvērtu proteomikas darbplūsmu.PDPL salīdzinājums ar TurboID parāda specifiskāku un visaptverošāku PDPL proteomisko pārklājumu.Mēs izmantojām šo pieeju subcelulārā proteoma organelliem specifiskajiem marķieriem un ar vēzi saistītā epiģenētiskā regulējošā proteīna BRD4 un ar Parkinsona slimību saistītās E3 ligāzes Parkin saistošo partneru vispārīgo proteomu identificēšanai, kas apstiprināja gan zināmu, gan nezināmu proteīnu tīklu. mijiedarbības..PDPL spēja atpazīt E3 substrātus lielos proteīnu kompleksos ir situācija, kad ir nepieciešama netiešo saistvielu atpazīšana.In situ ir apstiprināti divi nezināmi parkin substrāti, ko mediē ubikvitinācijas proteasoma.
Fotodinamiskā terapija (PDT)19 un lāzera inaktivācija ar hromoforu (CALI)20, kurā gaismas apstarošana ar fotosensibilizatoriem rada skābekli, var inaktivēt mērķa proteīnus vai izraisīt šūnu nāvi.Tā kā singleta skābeklis ir ļoti reaģējoša viela ar teorētisko difūzijas attālumu aptuveni 70 nm, var kontrolēt telpiski ierobežotu oksidāciju ap fotosensibilizatoru.Pamatojoties uz šo koncepciju, mēs nolēmām izmantot skābekli, lai panāktu proteīnu kompleksu ciešu marķēšanu dzīvās šūnās.Mēs esam izstrādājuši PDPL ķīmijproteomisko pieeju, lai izpildītu četras funkcijas: (1) katalizēt aktīvā singleta skābekļa veidošanos, kas ir līdzīga PL fermentatīvajai pieejai;(2) nodrošina laika izšķirtspējas marķēšanu pēc gaismas ierosināšanas;(3) ar izmaiņām (4) Izvairieties no endogēno kofaktoru (piemēram, biotīna) izmantošanas, lai samazinātu fonu, vai neizmantojiet ļoti traucējošus eksogēnus reaģentus (piemēram, peroksīdus), lai samazinātu šūnu pakļaušanu vides stresam.
Fotosensibilizatorus var iedalīt divās kategorijās, tostarp mazas molekulmasas fluoroforos (piemēram, rozā bengālija, metilēnzilā)22 un ģenētiski kodētos mazos proteīnus (piemēram, miniSOG, KillerRed)23.Lai panāktu modulāru dizainu, mēs izstrādājām pirmās paaudzes PDPL platformu, pievienojot POI24, 25 fotosensibilizatoru (PS) proteīnus (1.a attēls).Apstarojot ar zilu gaismu, viengabala skābeklis oksidē proksimālos nukleofīlo aminoskābju atlikumus, kā rezultātā veidojas elektrofīla polaritāte, kas var tālāk reaģēt ar amīna zondes nukleofīliem 16, 17.Zonde ir izstrādāta ar alkīna rokturi, lai nodrošinātu klikšķu ķīmiju un novelciet uz leju LC/MS/MS raksturošanai.
Shematisks ilustrācija proteīnu kompleksu marķēšanai, ko nodrošina miniSOG.Kad tās tiek pakļautas zilai gaismai, šūnas, kas ekspresē miniSOG-POI, rada vienotu skābekli, kas modificē mijiedarbojošos proteīnus, bet ne nesaistošos proteīnus.Fotooksidācijas starpproduktus pārtver amīna ķīmiskās zondes releju etiķetes, veidojot kovalentos aduktus.Alkinilgrupa uz ķīmijas zondes ļauj bagātināt klikšķu ķīmiju, nolaižot uz leju, pēc tam veicot LC-MS/MS kvantitatīvu noteikšanu.b Amīna zondes ķīmiskā struktūra 1-4.c Mitohondriju lokalizētu miniSOG mediētu proteomisko marķieru reprezentatīvā fluorescējošā gēla analīze, izmantojot zondes 1-4, un relatīvā kvantitatīva noteikšana, pamatojoties uz gēla densitometriju.Ķīmisko zondu signāla un fona attiecība tika novērtēta, izmantojot negatīvas kontroles eksperimentus, izņemot zilo gaismu vai izmantojot HEK293T šūnas bez miniSOG ekspresijas.n = 2 bioloģiski neatkarīgi paraugi.Katrs punkts ir bioloģiska kopija.d Reprezentatīva PDPL noteikšana un kvantitatīva noteikšana, izmantojot optimizētu zondi 3 norādīto PDPL komponentu klātbūtnē vai bez tiem, piemēram, c.n = 3 bioloģiski neatkarīgi paraugi.Katrs punkts ir bioloģiska kopija.Viduslīnijas un ūsas attēlo vidējo un ± standarta novirzi.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Singleta skābekļa konfokālā attēlveidošana ar tālu sarkanu Si-DMA traipu.Mēroga josla: 10 µm.Gēla attēlveidošana un konfokālie eksperimenti tika neatkarīgi atkārtoti vismaz divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem.
Vispirms mēs pārbaudījām nobriedušu fotosensibilizatoru miniSOG26 un KillerRed23 spēju, kas stabili izteikti HEK293T, būt par starpnieku proteomas propargilamīna marķēšanai kā ķīmiskai zondei (papildu attēls 1a).Gēla fluorescences analīze parādīja, ka visa proteomu marķēšana tika panākta, izmantojot miniSOG un zilās gaismas apstarošanu, savukārt ar KillerRed netika novērots redzams marķēšanas produkts.Lai uzlabotu signāla un fona attiecību, mēs pārbaudījām ķīmisko zondu komplektu, kas satur anilīnu (1 un 3), propilamīnu (2) vai benzilamīnu (4).Mēs novērojām, ka pašām HEK293T šūnām bija augstāks fona signāls, salīdzinot ar zilās gaismas neesamību, iespējams, endogēnā riboflavīna fotosensibilizatora flavīna mononukleotīda (FMN) 27 dēļ. Anilīna bāzes ķīmiskās zondes 1 un 3 sniedza labāku specifiku, HEK293T stabili ekspresējot miniSOG mitohondrijās, uzrādot vairāk nekā 8 reizes signāla pieaugumu zondei 3, savukārt zonde 2, kas tika izmantota RNS marķēšanas metodē CAP-seq, uzrādīja tikai ~ 2,5- signāla palielināšanās reizes, iespējams, RNS un proteīna atšķirīgās reaktivitātes izvēles dēļ (1.b, c att.). Anilīna bāzes ķīmiskās zondes 1 un 3 sniedza labāku specifiku, HEK293T stabili ekspresējot miniSOG mitohondrijās, uzrādot vairāk nekā 8 reizes signāla pieaugumu zondei 3, savukārt zonde 2, kas tika izmantota RNS marķēšanas metodē CAP-seq, uzrādīja tikai ~ 2,5- signāla palielināšanās reizes, iespējams, RNS un proteīna atšķirīgās reaktivitātes izvēles dēļ (1.b, c att.).Anilīna bāzes ķīmiskās zondes 1 un 3 uzrādīja labāku specifiku: HEK293T, kas stabili ekspresē miniSOG mitohondrijās, uzrāda vairāk nekā 8 reizes lielāku signāla pieaugumu 3. zondei, savukārt 2. zonde, ko izmanto CAP-seq RNS marķēšanas metodē, tikai. uzrāda ~ 2,5 reizes lielāku signāla pieaugumu, iespējams, RNS un proteīna atšķirīgās reaktivitātes izvēles dēļ (1.b, c att.).苯胺 的 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 好 特异性 特异性 ， hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用 于 RNA 标记 方法 方法 Cap-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 的 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilīna bāzes ķīmiskajām zondēm 1. un 3. bija labāka specifika, HEK293T stabili ekspresēja miniSOG mitohondrijās, un 3. zondei signāls palielinājās vairāk nekā 8 reizes, savukārt 2. zonde CAP-seq RNS marķēšanas metodei uzrādīja tikai ~ 2,5 reizes lielāku pieaugumu.signālā, iespējams, tāpēc, ka RNS un proteīna reakcijas preferences ir atšķirīgas (1.b, c. att.).Turklāt tika pārbaudīti zondes 3 izomēri un hidrazīna zondes (zondes 5, 6, 7), apstiprinot zondes 3 optimizāciju (papildu 1.b, c attēls).Līdzīgi gēla fluorescences analīze atklāja citus optimizētus eksperimentālos parametrus: apstarošanas viļņa garumu (460 nm), ķīmiskās zondes koncentrāciju (1 mM) un apstarošanas laiku (20 minūtes) (papildu 2.a–c attēls).Jebkura komponenta vai soļa izlaišana PDPL protokolā izraisīja ievērojamu signāla apvērsumu fonā (1.d attēls).Proti, olbaltumvielu marķēšana tika ievērojami samazināta nātrija azīda vai troloksa klātbūtnē, kas, kā zināms, dzēš skābekli.D2O klātbūtne, kas, kā zināms, stabilizē singleta skābekli, uzlabo marķēšanas signālu.Lai izpētītu citu reaktīvo skābekļa sugu ieguldījumu marķēšanā, tika pievienots mannīts un C vitamīns, lai izveidotu attiecīgi hidroksila un superoksīda radikāļu uztvērējus 18, 29, taču netika konstatēts, ka tie samazina marķējumu.H2O2 pievienošana, bet ne apgaismojums, neizraisīja marķēšanu (papildu 3.a attēls).Singleta skābekļa fluorescences attēlveidošana ar Si-DMA zondēm apstiprināja singleta skābekļa klātbūtni HEK293T-miniSOG vadā, bet ne oriģinālajā HEK293T vadā.Turklāt mitoSOX Red nevarēja noteikt superoksīda veidošanos pēc apgaismojuma (1.e attēls un papildu attēls 3b) 30. Šie dati liecina, ka singleta skābeklis ir galvenā reaktīvā skābekļa suga, kas ir atbildīga par turpmāko proteomisko marķēšanu.Tika novērtēta PDPL citotoksicitāte, ieskaitot zilās gaismas apstarošanu un ķīmiskās zondes, un netika novērota nozīmīga citotoksicitāte (papildu 4.a attēls).
Lai izpētītu marķēšanas mehānismu un ļautu proteomiski identificēt proteīnu kompleksus, izmantojot LC-MS / MS, vispirms ir jānosaka, kuras aminoskābes ir modificētas un zondes etiķešu delta masa.Ir ziņots, ka metionīnu, histidīnu, triptofānu un tirozīnu modificē singleta skābeklis14,15.Mēs integrējam TOP-ABPP31 darbplūsmu ar objektīvu atvērto meklēšanu, ko nodrošina FragPipe skaitļošanas platforma, kuras pamatā ir MSFragger32.Pēc singleta skābekļa modifikācijas un ķīmiskās zondes marķēšanas tika veikta klikšķu ķīmija, izmantojot biotīna samazināšanas etiķeti, kas satur šķeļamu saiti, kam sekoja neitravidīna stiepšana un tripsīna gremošana.Modificētais peptīds, kas joprojām bija saistīts ar sveķiem, tika fotošķelts LC-MS / MS analīzei (2.a attēls un 1. papildu dati).Liels skaits modifikāciju notika visā proteomā, un tika uzskaitītas vairāk nekā 50 peptīdu kartes (PSM) atbilstības (2.b attēls).Pārsteidzoši, mēs novērojām tikai histidīna modifikācijas, iespējams, tāpēc, ka oksidētā histidīna reaktivitāte pret anilīna zondēm ir augstāka nekā citām aminoskābēm.Saskaņā ar publicēto histidīna oksidācijas mehānismu ar singleta skābekli21,33 piedāvātā delta masas struktūra +229 Da atbilst zondes 3 aduktam ar 2-oksohistidīnu pēc divām oksidācijām, savukārt +247 Da ir hidrolīzes produkts. +229 Da (5. papildu attēls).MS2 spektra novērtējums uzrādīja augstu y un b jonu identifikācijas ticamību, tostarp modificēto fragmentu jonu (y un b) identifikāciju (2.c att.).PDPL modificēto histidīnu lokālās secības konteksta analīze atklāja mērenu motīvu izvēli maziem hidrofobiem atlikumiem ±1 pozīcijās (papildu 4.b attēls).Vidēji katram proteīnam tika identificēti 1,4 histidīni, un šo marķieru vietas tika noteiktas, izmantojot šķīdinātājam pieejamās virsmas laukuma (SASA) un relatīvās šķīdinātāja pieejamības (RSA) analīzi (papildu 4.c, d attēls).
Neobjektīva darbplūsma atlikušās selektivitātes izpētei, izmantojot FragPipe skaitļošanas platformu, ko darbina MSFragger.Sadalāmie linkeri tiek izmantoti Click ķīmijā, lai nodrošinātu modificētu peptīdu fotošķelšanos no streptavidīna sveķiem.Tika uzsākta atklāta meklēšana, lai identificētu daudzas modifikācijas, kā arī attiecīgās paliekas.b Piešķiriet visā proteomā notiekošo modifikāciju masu.Peptīdu kartēšana PSM.c MS2 spektrālā anotācija histidīna vietām, kas modificētas ar zondi 3. Kā reprezentatīvs piemērs, kovalentā reakcija ar zondi 3 modificētajai aminoskābei pievienoja +229,0938 Da.d Mutācijas tests, ko izmanto, lai pārbaudītu PDPL marķierus.PRDX3 (H155A, H225A) un PRDX1 (H10A, H81A, H169A) tika transficēti ar savvaļas tipa plazmīdām anti-Flag noteikšanai.e Sintētiskais peptīds tika reaģēts ar attīrītu miniSOG zondes 3 klātbūtnē, un attiecīgie produkti ar Δm +247 un +229 tika atzīmēti LC-MS spektrā.f In vitro proteīnu mijiedarbība ar proteīnu, kas modelēta ar miniSOG-6xHis-tag un anti-6xHis antivielu.Antibiotīns (streptavidīns-HRP) un anti-peles Western blot analīze miniSOG-6xHis/anti-6xHis antivielu kompleksiem, kas marķēti ar zondi 3, atkarībā no gaismas iedarbības laika.Atsevišķu proteīnu etiķetes ir izteiktas atbilstošā molekulmasā: LC antivielu vieglā ķēde, HC antivielu smagā ķēde.Šie eksperimenti tika neatkarīgi atkārtoti vismaz divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem.
Lai veiktu marķēšanas vietas bioķīmisko pārbaudi, PRDX3 un PRDX1, kas identificēti ar masas spektrometriju, tika mainīti no histidīna uz alanīnu un salīdzināti ar savvaļas tipu transfekcijas testos.PDPL rezultāti parādīja, ka mutācija ievērojami samazināja marķēšanu (2.d attēls).Tikmēr atklātajā meklēšanā identificētās peptīdu sekvences tika sintezētas un in vitro reaģētas ar attīrītu miniSOG zondes 3 un zilās gaismas klātbūtnē, iegūstot produktus ar masas nobīdi +247 un +229 Da, kad to noteica LC-MS (att. 2e).).Lai pārbaudītu, vai mijiedarbojošos proksimālos proteīnus var marķēt in vitro, reaģējot uz miniSOG fotoaktivāciju, mēs izstrādājām mākslīgu tuvuma testu, mijiedarbojoties starp miniSOG-6xHis proteīnu un anti-His monoklonālo antivielu in vitro (2.f attēls).Šajā testā mēs gaidījām antivielu smago un vieglo ķēžu proksimālu marķēšanu ar miniSOG.Faktiski anti-peles (atpazīstot ar anti-6xHis iezīmētās antivielas smagās un vieglās ķēdes) un streptavidīna Western blots uzrādīja spēcīgu smago un vieglo ķēžu biotinilāciju.Proti, mēs pamanījām miniSOG autobiotinilāciju, pateicoties 6xHis marķējumam un šķērssaistēm starp vieglajām un smagajām ķēdēm, kas var būt saistītas ar iepriekš aprakstīto plaisu starp lizīnu un 2-oksohistidīna proksimālo reakciju.Noslēgumā mēs secinām, ka PDPL modificē histidīnu atkarībā no tuvuma.
Mūsu nākamais mērķis bija raksturot subcelulāro proteomu, lai pārbaudītu in situ marķēšanas specifiku.Tāpēc mēs stabili paudām miniSOG HEK293T šūnu kodolā, mitohondriju matricā vai ārējā ER membrānā (3.a attēls).Gēla fluorescences analīze atklāja bagātīgas marķētas joslas trīs subcelulārās vietās, kā arī dažādus marķēšanas modeļus (3.b attēls).Fluorescences attēlveidošanas analīze parādīja augstu PDPL specifiskumu (3.c attēls).PDPL darbplūsmai sekoja klikšķu reakcijas ar rodamīna krāsām, lai noteiktu subcelulāros proteomas, izmantojot fluorescences mikroskopiju, un PDPL signāli tika kolokalizēti ar DAPI, mitohondriju izsekotājiem vai ER izsekotājiem, apstiprinot PDPL augsto precizitāti.Trīs organellu atrašanās vietām PDPL salīdzinājums ar TurboID, izmantojot avidīna Western blot, parādīja, ka PDPL tika marķēts precīzāk, salīdzinot ar to attiecīgajām kontrolēm.PDPL apstākļos parādījās vairāk marķētu joslu, kas norāda uz vairāk ar PDPL iezīmētu proteīnu (papildu 6.a-d attēls).
shematisks miniSOG mediētās organellu specifiskās proteomu marķēšanas attēlojums.miniSOG ir vērsta uz mitohondriju matricu, saplūstot ar cilvēka COX4 (mito-miniSOG) N-gala 23 aminoskābēm, kodolu, saplūstot ar H2B (kodols-miniSOG), un Sec61β caur ER membrānas citoplazmas pusi (ER-miniSOG). ).Indikācijas ietver gēla attēlveidošanu, konfokālo attēlveidošanu un masas spektrometriju.b Reprezentatīvi trīs organellām raksturīgu PDPL profilu gēla attēli.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentatīvi HEK293T šūnu konfokālie attēli, kas stabili ekspresē miniSOG ar dažādām subcelulārām lokalizācijām, ko atklāj antiviela, kas marķēta ar V5 (sarkana).Subcelulārie marķieri tiek izmantoti mitohondrijiem un ER (zaļi).PDPL darbplūsma ietver miniSOG (dzeltenā krāsā) marķētu subcelulāro proteomu noteikšanu, izmantojot Cy3-azīda klikšķu ķīmiju.Mēroga josla: 10 µm.d PDPL marķētu proteomu vulkāniskie parauglaukumi dažādās organellās, kas kvantificēti ar nemarķētu kvantitatīvu noteikšanu (n = 3 neatkarīgi bioloģiskie eksperimenti).Divpusēji Stjudenta t-tests tika izmantots vulkānu parauglaukumos.HEK293T savvaļas tips tika izmantots kā negatīva kontrole. Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un >2 reizes jonu intensitātes atšķirība). Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un >2 reizes jonu intensitātes atšķirība). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un >2 reizes atšķiras jonu intensitāte).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un > 2 reizes atšķiras jonu stiprums).Saistītie proteīni, kas ir svarīgi HEK293T-miniSOG, bet nav svarīgi HEK293T, ir parādīti zaļā krāsā.e Eksperimentu proteomisko datu kopu specifikas analīze d.Kopējais statistiski nozīmīgu olbaltumvielu skaits katrā organellā (sarkanie un zaļie punkti) ir atzīmēts augšpusē.Histogrammas parāda proteīnus, kas lokalizēti organellās, pamatojoties uz MitoCarta 3.0, GO analīzi un A. Ting et al.cilvēkiem.Atsevišķas datu kopas mitohondrijiem, kodoliem un ER.Šie eksperimenti tika neatkarīgi atkārtoti vismaz divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem.Neapstrādāti dati tiek nodrošināti neapstrādātu datu failu veidā.
Gēla un attēlveidošanas rezultātu mudināts, kvantitatīvā noteikšana bez etiķetes tika izmantota, lai kvantitatīvi noteiktu identificēto proteomu katrā organellā (2. papildu dati).Netransficēts HEK293T tika izmantots kā negatīva kontrole, lai atņemtu fona marķierus. Vulkānu diagrammas analīze parādīja ievērojami bagātinātus proteīnus (p < 0,05 un> 2 reizes jonu intensitāti), kā arī atsevišķus proteīnus, kas ir tikai miniSOG ekspresējošās līnijās (3. att. sarkanie un zaļie punkti). Vulkānu diagrammas analīze parādīja ievērojami bagātinātus proteīnus (p < 0,05 un> 2 reizes jonu intensitāti), kā arī atsevišķus proteīnus, kas ir tikai miniSOG ekspresējošās līnijās (3. att. sarkanie un zaļie punkti). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkānu diagrammas analīze uzrādīja ievērojami bagātinātus proteīnus (p<0,05 un> 2 reizes lielāku jonu intensitāti), kā arī atsevišķus proteīnus, kas atrodas tikai miniSOG ekspresējošās līnijās (3.d attēls, sarkani un zaļi punkti).火山图 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 和 绿色点）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）火山图 显示 出 显着 的 蛋白质 （（P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 绿色点 。。。））））））））））） 绿色点 。。。））））））））））））） 绿色点 。。。））））））））））））） 绿色点 。。。）））））））））））））） 绿色点 。。。））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkāna diagrammas analīze atklāja ievērojami bagātinātus proteīnus (p<0,05 un> 2x jonu stiprumu), kā arī atsevišķus proteīnus, kas atrodas tikai miniSOG ekspresijas līnijā (sarkani un zaļi punktiņi 3.d attēlā).Apvienojot šos datus, mēs identificējām attiecīgi 1364, 461 un 911 statistiski nozīmīgus kodola, mitohondriju un ER ārējās membrānas proteīnus.Lai analizētu organellās lokalizētās PDPL precizitāti, mēs izmantojām MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analīzi un A. Ting et al.datu kopa8 tika izmantota mitohondrijiem, kodolam un ER, lai pārbaudītu konstatēto proteīnu organellu specifiku, kas atbilst 73,4, 78,5 un 73,0% precizitātei (3.e attēls).PDPL specifika apstiprina, ka PDPL ir ideāls instruments organellām raksturīgu proteomu identificēšanai.Proti, identificēto mitohondriju proteīnu iesniedzohondriju analīze parādīja, ka iesprostotais proteoms galvenokārt tika izplatīts matricā un iekšējā membrānā (attiecīgi 226 un 106), kas veido 91, 7% (362) no kopējā identificēto mitohondriju proteīnu skaita.papildus tika apstiprināts augsts PDPL līmenis (papildu 7.a attēls).Līdzīgi, subnukleārā analīze parādīja, ka notvertais proteoms galvenokārt tika izplatīts kodolā, nukleoplazmā un kodolā (papildu 7.b attēls).Kodolproteomiskā analīze ar kodola lokalizācijas signāla peptīdu (3xNLS) uzrādīja līdzīgu precizitāti kā H2B konstrukcijai (papildu 7.c–h attēls).Lai noteiktu PDPL marķiera specifiku, kodola laminīns A tika izvēlēts kā diskrētāk lokalizēts POI7 slazds.PDPL identificēja 36 ievērojami bagātinātus proteīnus, no kuriem 12 proteīni (30,0 %, ieskaitot A laminātu) bija labi raksturoti A lamināta mijiedarbības proteīni, kas anotēti String datubāzē, ar lielāku procentuālo daudzumu nekā BioID metode (122 proteīni) 28 no 28. , 22.9 %) 7. Mūsu metode identificēja mazāk proteīnu, iespējams, ierobežoto marķēšanas apgabalu dēļ, ko ļāva aktīvāks singleta skābeklis.GO analīze parādīja, ka identificētie proteīni galvenokārt atradās nukleoplazmā (26), kodola membrānā (10), kodola membrānā (9) un kodola porās (5).Kopumā šie kodollokalizētie proteīni veidoja 80% no bagātinātajiem proteīniem, vēl vairāk pierādot PDPL specifiku (papildu 8.a–d attēls).
Noskaidrojot PDPL spēju veikt tuvuma marķēšanu organellās, mēs pārbaudījām, vai PDPL var izmantot, lai analizētu POI saistošos partnerus.Jo īpaši mēs centāmies definēt citozola proteīnu PDPL analīzi, kas tiek uzskatīti par grūtākiem mērķiem nekā to membrānas lokalizētie kolēģi to ļoti dinamiskā rakstura dēļ.Bromodomēna un ekstraterminālais (BET) proteīns BRD4 ir piesaistījis mūsu uzmanību ar savu galveno lomu dažādās slimībās 35, 36 .BRD4 veidotais komplekss ir transkripcijas koaktivators un svarīgs terapeitiskais mērķis.Regulējot c-myc un Wnt5a transkripcijas faktoru ekspresiju, tiek uzskatīts, ka BRD4 ir galvenais akūtas mieloleikozes (AML), multiplās mielomas, Burkitta limfomas, resnās zarnas vēža un iekaisuma slimību noteicošais faktors37, 38.Turklāt daži vīrusi ir vērsti uz BRD4, lai regulētu vīrusu un šūnu transkripciju, piemēram, papilomas vīruss, HIV un SARS-CoV-236,39.
Lai kartētu BRD4 mijiedarbību, izmantojot PDPL, mēs apvienojām miniSOG ar īsu BRD4 N- vai C-termināla izoformu.Proteomiskie rezultāti atklāja augstu abu konstrukciju pārklāšanās pakāpi (papildu 9.a attēls).Kodolproteoms, kas identificēts ar miniSOG-H2B, aptver 77,6% proteīnu, kas mijiedarbojas ar BRD4 (papildu 9.b attēls).Pēc tam marķiera rādiusa regulēšanai tika izmantoti dažādi apgaismojuma laiki (2, 5, 10, 20 min) (4.a attēls un 3. papildu dati).Mēs secinām, ka īsākos fotoperiodos PDPL galvenokārt marķēs tiešos saistīšanās partnerus, savukārt ilgākos periodos tiks iekļauti proteīni, kas identificēti īsākos fotoaktivācijas periodos, kā arī netiešie mērķi marķēšanas kompleksos.Faktiski mēs atklājām spēcīgu pārklāšanos starp blakus esošajiem laika punktiem (84,6% 2 un 5 minūtēm; 87,7% 5 un 10 minūtēm; 98,7% 10 un 20 minūtēm) (4.b attēls un papildu attēls 9c).Visās eksperimentālajās grupās mēs atradām ne tikai BRD4 pašmarķēšanu, bet arī vairākus zināmus mērķus, piemēram, MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A un HMGB1, kas anotēti virkņu datu bāzē.Šo mērķu jonu stiprums ir proporcionāls ekspozīcijas laikam (4.c attēls un papildu 9.d attēls).2 minūšu grupā identificēto proteīnu GO analīze parādīja, ka identificētie proteīni bija lokalizēti kodolā un bija iesaistīti hromatīna remodelēšanā un RNS polimerāzes funkcijā.Proteīna molekulārā funkcija tika bagātināta ar hromatīna saistīšanos vai transkripcijas koaktivāciju, kas atbilst BRD4 funkcijai (4. d attēls).Virkņu datu bāzē iespējota proteīnu mijiedarbības analīze atklāja pirmo netiešo mijiedarbības līmeni starp BRD4 un HDAC saimes kompleksiem, kas mijiedarbojas, piemēram, SIN3A, NCOR2, BCOR un SAP130 (4.e attēls un papildu 9.e attēls), kas atbilst BRD4 un HDAC saistošajiem acetilētajiem histoniem. ..Turklāt reprezentatīvie mērķi, kas identificēti ar LC-MS/MS, tostarp Sin3A, NSUN2, Fus un SFPQ, tika apstiprināti ar Western blotēšanu (4. fig.).Nesen tika ziņots, ka BRD4 īsā izoforma veido kodolus ar šķidruma un šķidruma fāzes atdalīšanas (LLPS) īpašībām.RNS saistošie proteīni Fus un SFPQ mediē dažādu šūnu procesu LLPS, un šeit ir identificēti kā nereģistrēti BRD4 saistošie proteīni.Mijiedarbība starp BRD4 un SFPQ tika apstiprināta ar līdzimunoprecipitācijas (ko-IP) eksperimentiem (4.g attēls), kas liecina par citu mehānismu BRD4 mediētās šķidruma un šķidruma fāzes atdalīšanai, kas ir pelnījis turpmāku izmeklēšanu.Kopumā šie rezultāti liecina, ka PDPL ir ideāla platforma zināmu BRD4 mijiedarbojošo, kā arī nezināmo saistošo proteīnu identificēšanai.
a shematisks miniSOG starpniecības BRD4 tuvuma marķējuma attēlojums, ekspozīcijas laiki: 2, 5, 10 un 20 min.b Proteīnu pārklāšanās, kas identificēta dažādos apgaismojuma laikos.Olbaltumvielu bagātināšana, kas identificēta HEK293T-miniSOG-BRD4, bija statistiski nozīmīga salīdzinājumā ar savvaļas tipa HEK293T.c Jonu intensitāte, nosakot nemarķēto reprezentatīvo zināmo BRD4 saistošo proteīnu daudzumu norādītajā ekspozīcijas laikā.n = 3 bioloģiski neatkarīgi paraugi.Dati ir parādīti kā vidējā ± standarta novirze.d 2 minūšu grupā identificēto proteīnu gēnu ontoloģiskā analīze (GO).Ir uzskaitīti pirmie desmit GO termini.Burbuļi ir iekrāsoti atbilstoši GO terminu kategorijai, un burbuļu izmērs ir proporcionāls katrā terminā atrasto olbaltumvielu skaitam.e Proteīnu virkņu analīze, kas mijiedarbojas ar BRD4.Dzeltenie apļi ir tiešā līme, bet pelēkie apļi ir pirmais netiešās līmes slānis.Sarkanās līnijas apzīmē eksperimentāli noteiktās mijiedarbības, un zilās līnijas apzīmē paredzētās mijiedarbības.f Reprezentatīvie BRD4 saistošie mērķi, kas identificēti LC-MS/MS, tika pārbaudīti ar Western blot metodi.g Kopimunoprecipitācijas eksperimenti apstiprina mijiedarbību starp SFPQ un BRD4.Šie eksperimenti tika neatkarīgi atkārtoti vismaz divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem.Neapstrādāti dati tiek nodrošināti neapstrādātu datu failu veidā.
Papildus nereģistrētu POI saistītu mērķu identificēšanai mēs izvirzām hipotēzi, ka PDPL būs piemērots enzīmu substrātu identificēšanai, kam būtu nepieciešams raksturot netiešās saistošās olbaltumvielas lielos kompleksos, lai anotētu nereģistrētus substrātus.Parkins (ko kodē PARK2) ir E3 ligāze, un ir zināms, ka parkina mutācijas izraisa autosomāli recesīvu juvenīlo Parkinsona slimību (AR-JP)42.Turklāt parkins ir aprakstīts kā būtisks mitofagijai (mitohondriju autofagijai) un reaktīvo skābekļa sugu noņemšanai.Tomēr, lai gan ir identificēti vairāki parkīna substrāti, parkin loma šajā slimībā joprojām nav skaidra.Lai anotētu tā neraksturīgos substrātus, PDPL tika pārbaudīts, pievienojot miniSOG parkina N- vai C-galam.Šūnas tika apstrādātas ar karbonilcianīda protonu transportētāju m-hlorfenilhidrazonu (CCCP), lai aktivizētu parkinu caur PINK1-Parkin ceļu.Salīdzinot ar mūsu BRD4 PDPL rezultātiem, parkina N-gala saplūšana atklāja lielāku mērķa proteīnu kopumu, lai gan tas aptvēra lielāku C-gala daļu (177 no 210) (5.a, b attēls un 4. papildu dati).rezultāts atbilst ziņojumiem, ka N-termināla tagi var neparasti aktivizēt Parkin44.Pārsteidzoši, ka mūsu datos bija tikai 18 proteīni, kas pārklājās ar publicētajiem AP-MS rezultātiem par Parkin43, iespējams, pateicoties atšķirībām starp šūnu līnijām un proteomikas darbplūsmām.Papildus četriem zināmajiem proteīniem (ARDM1, HSPA8, PSMD14 un PSMC3), kas identificēti ar divām metodēm (5.c att.)43.Lai vēl vairāk apstiprinātu LC-MS/MS rezultātus, PDPL apstrāde un sekojošā Western blotēšana tika izmantota, lai salīdzinātu HEK293T vecāku šūnu testa rezultātus ar stabilu N-termināla parkina līniju.Iepriekš nezināmie mērķi CDK2, DUT, CTBP1 un PSMC4 tika pārbaudīti ar zināmu saistvielu DNAJB1 (5.d attēls).
Parkīnu mijiedarbojošo proteīnu vulkāna diagramma HEK293T šūnās ar stabili ekspresētu miniSOG, kas sakausēts ar parkīna N- vai C-galu (n = 3 neatkarīgi bioloģiskie eksperimenti).Divpusēji Stjudenta t-tests tika izmantots vulkānu parauglaukumos.HEK293T tika izmantots kā negatīva kontrole. Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un >2 reizes jonu intensitātes atšķirība). Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un >2 reizes jonu intensitātes atšķirība). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un >2 reizes atšķiras jonu intensitāte).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ievērojami izmainītās olbaltumvielas ir izceltas sarkanā krāsā (p < 0,05 un > 2 reizes atšķiras jonu stiprums).Saistītie proteīni, kas ir svarīgi HEK293T-miniSOG, bet nav svarīgi HEK293T, ir parādīti zaļā krāsā.b Venn diagramma, kas parāda proteīnu pārklāšanos starp N-gala un C-gala konstrukcijām.N-termināla tagi var neparasti aktivizēt parkinu un radīt atpazīstamākus proteīnus.c Venn diagramma, kas parāda proteīnu pārklāšanos starp PDPL un AP-MS.Ir uzskaitīti zināmie mijiedarbības dalībnieki, tostarp 4 no 18 proteīniem, kas pārklājas, un 11 no 159 proteīniem, kas īpaši identificēti PDPL.d Reprezentatīvie mērķi, kas identificēti ar LC-MS/MS, tika pārbaudīti ar Western blot metodi.e Ssu72 un SNW1 tika identificēti kā nereģistrēti parkin substrāti.Šīs FLAG marķētās olbaltumvielu plazmīdas tika transficētas HEK293T un HEK293T-Parkin-miniSOG, kam sekoja CCCP apstrāde dažādos laika punktos.Degradācija bija izteiktāka Parkin pārmērīgas ekspresijas līnijā.f Izmantojot proteasomu inhibitoru MG132, tika apstiprināts, ka Ssu72 un SNW1 degradācijas procesu veicina proteasomu ubikvitinācija.Šie eksperimenti tika neatkarīgi atkārtoti vismaz divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem.Neapstrādāti dati tiek nodrošināti neapstrādātu datu failu veidā.
Proti, PDPL identificētajos proteīnos jāiekļauj parkinu saistošie proteīni un to substrāti.Lai noteiktu nereģistrētus parkina substrātus, mēs atlasījām septiņus identificētus proteīnus (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 un SNW1) un transfektētās plazmīdas, lai šos gēnus pakļautu normālam HEK293T un stabili ekspresētu miniSOG-Parkin's ārstēšanu, kam sekoja CC293 apstrāde.Ssu72 un SNW1 proteīnu līmenis bija ievērojami samazināts stabilajā miniSOG-Parkin līnijā (5.e att.).Apstrāde ar CCCP 12 stundas izraisīja abu substrātu nozīmīgāko degradāciju.Lai izpētītu, vai Ssu72 un SNW1 noārdīšanos regulē proteasomu ubikvitinācija, tika pievienots proteasomu inhibitors MG132, lai inhibētu proteasomu aktivitāti, un faktiski mēs atklājām, ka to degradācijas process tika inhibēts (5.f att.).Papildu mērķi, kas nav substrāti, tika apstiprināti kā Parkina mijiedarbības dalībnieki, izmantojot Western blotēšanu (10. papildu att.), kas uzrādīja konsekventus rezultātus ar LC-MS/MS.Noslēgumā jāsaka, ka PDPL darbplūsmas integrācija ar mērķa proteīna transfekcijas verifikāciju ļauj identificēt nereģistrētus E3 ligāzes substrātus.
Mēs esam izstrādājuši kopēju tuvuma marķēšanas platformu, kas ļauj identificēt telpā un laikā mijiedarbojošos POI.Platformas pamatā ir miniSOG fotosensibilizatora proteīns, kas ir tikai aptuveni 12 kDa, mazāks par pusi no nobriedušā APEX2 enzīma (27 kDa) un viena trešdaļa no TurboID izmēra (35 kDa).Mazākam izmēram vajadzētu ievērojami paplašināt lietojumu klāstu mazu proteīnu interaktomu pētīšanai.Ir nepieciešama papildu fotosensibilizatoru, neatkarīgi no tā, vai tie ir ģenētiski kodēti proteīni vai mazas molekulas, izpēte, lai palielinātu singleta skābekļa kvantu iznākumu un paplašinātu šīs pieejas jutīgumu.Pašreizējai miniSOG versijai augstu laika izšķirtspēju var sasniegt, izmantojot zilu apgaismojumu, lai aktivizētu tuvuma marķierus.Turklāt ilgāks ekspozīcijas laiks atbrīvoja lielāku skābekļa “mākoni”, kā rezultātā tika modificēti distālāki histidīna atlikumi, palielināts marķēšanas rādiuss un iespēja precīzi noregulēt PDPL telpisko izšķirtspēju.Mēs arī pārbaudījām septiņas ķīmiskās zondes, lai palielinātu signāla un fona attiecību, un izpētījām šīs pieejas molekulāro mehānismu.TOP-ABPP darbplūsma apvienojumā ar objektīvu atvērto meklēšanu apstiprināja, ka izmaiņas notika tikai histidīnos un netika novērota konsekventa mikrovide palielinātām histidīna modifikācijām, izņemot mērenu histidīnu izvēli cilpas reģionā.
PDPL ir izmantots arī, lai raksturotu subcelulārās proteomas ar proteomu specifiku un pārklājumu, kas ir vismaz salīdzināms ar citām tuvuma marķēšanas un organellām specifiskām ķīmiskās zondes metodēm.Tuvuma marķieri ir veiksmīgi izmantoti arī virsmas, lizosomu un ar sekrēciju saistīto proteomu raksturošanai 46, 47.Mēs uzskatām, ka PDPL būs savietojams ar šīm subcelulārajām organellām.Turklāt mēs apstrīdējām PDPL, identificējot citozola proteīnu saistīšanās mērķus, kas ir sarežģītāki nekā ar membrānu saistītie proteīni to dinamisko īpašību un iesaistīšanās laika mijiedarbībās dēļ.PDPL tika piemērots diviem proteīniem, transkripcijas koaktivatoram BRD4 un ar slimību saistītajai ligazei E3 Parkin.Šīs divas olbaltumvielas tika izvēlētas ne tikai to fundamentālo bioloģisko funkciju, bet arī to klīniskās nozīmes un terapeitiskā potenciāla dēļ.Šiem diviem POI tika identificēti labi zināmi saistošie partneri, kā arī nereģistrēti mērķi.Proti, ar fāzu atdalīšanu saistīto proteīnu SFPQ apstiprināja ko-IP, kas var norādīt uz jaunu mehānismu, ar kuru BRD4 (īsā izoforma) regulē LLPS.Tajā pašā laikā mēs uzskatām, ka Parkin substrātu identificēšana ir scenārijs, kurā ir nepieciešama netiešo līmju identificēšana.Mēs identificējām divus neidentificētus parkina substrātus un apstiprinājām to degradāciju pa ubikvitinācijas-proteasomu ceļu.Nesen tika izstrādāta uz mehānismu balstīta slazdošanas stratēģija, lai noteiktu hidrolāzes substrātus, notverot tos ar fermentiem.Lai gan šī ir ļoti spēcīga metode, tā nav piemērota lielu kompleksu veidošanā iesaistīto substrātu analīzei un prasa kovalento saišu veidošanos starp fermentu un substrātu.Mēs sagaidām, ka PDPL var paplašināt, lai pētītu citus proteīnu kompleksus un enzīmu ģimenes, piemēram, deubikvitināzes un metaloproteāzes ģimenes.
Ir izstrādāta jauna miniSOG forma, ko sauc par SOPP3, ar uzlabotu skābekļa ražošanu.Mēs salīdzinājām miniSOG ar SOPP3 un konstatējām uzlabotu marķēšanas veiktspēju, lai gan signāla un trokšņa attiecība nemainījās (papildu 11. attēls).Mēs izvirzījām hipotēzi, ka SOPP3 optimizācija (piemēram, ar virzītu evolūciju) novedīs pie efektīvākiem fotosensibilizatoriem, kuriem nepieciešams īsāks gaismas laiks un tādējādi ļauj uztvert dinamiskākus šūnu procesus.Proti, pašreizējā PDPL versija ir ierobežota ar šūnu vidi, jo tai ir nepieciešams zilas gaismas apgaismojums un tā nevar iekļūt dziļos audos.Šī funkcija neļauj to izmantot dzīvnieku modeļu pētījumos.Tomēr optoģenētikas kombinācija ar PDPL varētu sniegt iespēju pētījumiem ar dzīvniekiem, īpaši smadzenēs.Turklāt citi infrasarkano staru fotosensibilizatori arī novērš šo ierobežojumu.Pašlaik šajā jomā tiek veikti pētījumi.
HEK293T šūnu līnija tika iegūta no ATCC (CRL-3216).Šūnu līnija tika pārbaudīta uz mikoplazmas infekciju, un tā tika kultivēta DMEM (Thermo, #C11995500BT), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu (FBS, Vistech, #SE100-B) un 1% penicilīna/streptomicīna (Hyclone, #SV30010).ieaudzis.
3-aminofenilēns (3. paraugs) un (4-etinilfenil)metānamīns (4. paraugs) tika iegādāti no Bidepharm.Propilamīns (2. zonde) tika iegādāts no Energy-chemicals.N-(2-aminofenil)pent-4-inamīds (zonde 1) tika sintezēts saskaņā ar publicētajām metodēm.
Papildu tabulā 1 ir uzskaitītas šajā pētījumā izmantotās ģenētiskās konstrukcijas.MiniSOG un KillerRed sekvences tika klonētas no P. Zou (Pekinas Universitāte) dāvanas plazmīdas.Mitohondriju matricas mērķauditorijas atlases secība tika iegūta no 23 COX4 N-gala aminoskābēm un klonēta norādītajos vektoros, izmantojot Gibson komplektu (Beyotime, # D7010S).Lai mērķētu uz endoplazmatiskā tīkla membrānu un kodolu, SEC61B cilvēka DNS (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), kas pastiprināta ar PCR no HEK293T šūnu cDNS bibliotēkas, un H2B DNS (ziedojusi D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) un klonēti, kā minēts iepriekš.Ja nav norādīts citādi, citi proteīnu gēni, ko izmantoja transfekcijai un stabilu šūnu līniju veidošanai, tika pastiprināti ar PCR no HEK293T šūnu cDNS bibliotēkas.G3S (GGGS) un G4S (GGGGS) tika izmantoti kā savienotāji starp ēsmas proteīnu un miniSOG.Šīm saplūšanas konstrukcijām tika pievienots V5 epitopa marķējums (GKPIPNPLLGLDST).Ekspresijai zīdītājiem un stabilas šūnu līnijas izveidošanai miniSOG saplūšanas konstrukcija tika subklonēta pLX304 lentivīrusu vektorā.Baktēriju ekspresijai miniSOG tika klonēts pET21a vektorā, kas C-galā marķēts ar 6xHis.
HEK293T šūnas tika iesētas ar 2,0 x 105 šūnām katrā iedobē sešu iedobju plāksnēs un 24 stundas vēlāk transficētas ar rekombinantām lentivīrusu plazmīdām (2,4 μg pLX304) un vīrusu iepakojuma plazmīdām (1,5 μg psPAX2 un 1,2 μg psPAX2 un 1,2 μg0g) ar p0MDBeyo. , #C0533), aptuveni 80% saplūšana.Pēc transfekcijas uz nakti barotne tika nomainīta un inkubēta vēl 24 stundas.Vīrusa savākšana tika veikta pēc 24, 48 un 72 stundām.Pirms mērķa šūnu līniju inficēšanas vīrusu barotne tika filtrēta caur 0, 8 μm filtru (Merck, #millex-GP) un tika pievienots polibrēns (Solarbio, # H8761) līdz koncentrācijai 8 μg / ml.Pēc 24 stundām šūnām ļāva atgūties, mainot barotni.Šūnas tika atlasītas, izmantojot 5 μg/ml blasticidīnu (Solarbio, #3513-03-9) pirmajām trim pasāžām kā zemāku stingru atlasi.Pēc tam izmantoja 20 μg/ml kā stingrāku režīmu nākamajiem trim fragmentiem.
Šūnas tika iesētas 12 bedrīšu kamerās (Ibidi, #81201) ar blīvumu aptuveni 20 000 šūnu vienā iedobē.Lai uzlabotu HEK293T šūnu adhēziju, pievienojiet 50 µg/ml fibronektīna (Corning, #356008), kas atšķaidīts ar fosfātu buferšķīdumu (PBS, Sangon, #B640435) 37 °C temperatūrā.Kameras tika iepriekš apstrādātas 1 stundu un pēc tam noņemtas ar PBS.Pēc 24 stundām šūnas vienu reizi nomazgāja ar PBS, inkubēja ar 1 mM zondi 3 svaigā Henksa līdzsvarotā sāls šķīdumā (HBSS, Gibco, #14025092) 1 stundu 37 °C temperatūrā un pēc tam inkubēja ar zilu LED (460 nm). ).) tika apstaroti 10 minūtes istabas temperatūrā.Pēc tam šūnas divas reizes nomazgāja ar PBS un fiksēja ar 4% formaldehīdu PBS (Sangon, # E672002) 15 minūtes istabas temperatūrā.Formaldehīda pārpalikums tika noņemts no fiksētajām šūnām, trīs reizes mazgājot ar PBS.Pēc tam šūnas tika permeabilizētas ar 0, 5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) PBS un 3 reizes mazgātas ar PBS.Pēc tam noņemiet kameru un pievienojiet katram paraugam 25 µl klikšķa reakcijas maisījuma, kas satur 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4). un 0,5 mg/ml nātrija askorbāta (Aladdin, Nr. S105024) un inkubēja 30 minūtes istabas temperatūrā.Pēc snap reakcijas šūnas sešas reizes mazgāja ar PBS, kas satur 0, 05% Tween-20 (Sangon, # A600560) (PBST), un pēc tam bloķēja ar 5% BSA (Abcone, # B24726) PBST 30 minūtes istabas temperatūrā.
Kolokalizācijas imūnkrāsošanai šūnas tika inkubētas ar primārajām antivielām saskaņā ar norādītajiem nosacījumiem: peles anti-V5 marķējuma mAb (1:500, CST, #80076), trušu anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABklonāls, #A0564), truša poliklonālā anti-kalneksīna antiviela (1:500, Abcam, #ab22595) vai truša anti-lamīna A/C monoklonālā antiviela (1:500; CST, #2032) 4 °C uz nakti.Pēc 3 reizes mazgāšanas ar PBST šūnas tika inkubētas ar sekundārajām antivielām: kazu anti-trušu Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034), kas atšķaidīts 1:1000, kazas pretpeles Alexa Fluor 594 (CST, # 8889), atšķaidīts 1:100.atšķaidīšana Atšķaida istabas temperatūrā 30 minūtes.Pēc tam šūnas 3 reizes mazgāja ar PBST un 10 minūtes istabas temperatūrā krāsoja ar DAPI (Thermo, # D1306) PBS.Pēc 3 mazgāšanas ar PBS šūnas tika noslēgtas 50% glicerīnā (Sangon, #A600232) PBS attēlveidošanai.Imunofluorescējošie attēli tika iegūti, izmantojot ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokālo mikroskopu un ZNE 3.5 programmatūru.
Singleta skābekļa fluorescējošai attēlveidošanai šūnas divas reizes nomazgāja ar Hanks HEPES buferšķīdumu, pirms pievienoja 100 nM Si-DMA Hanks HEPES buferšķīdumā (DOJINDO, # MT05).Pēc gaismas iedarbības šūnas 45 minūtes inkubēja CO2 inkubatorā 37 ° C temperatūrā.Pēc tam šūnas divas reizes mazgāja ar Hanksa HEPES buferšķīdumu un 10 minūtes istabas temperatūrā iekrāsoja ar Hoechst Hanks HEPES buferšķīdumā un vizualizēja, izmantojot ZEISS LSM 900 konfokālo mikroskopu., #M36008) HBSS buferšķīdumā, kas satur kalciju un magniju.Pēc gaismas vai doksorubicīna (MCE, #HY-15142A) iedarbības šūnas 10 minūtes inkubēja CO2 inkubatorā 37 ° C temperatūrā, divas reizes mazgāja ar HBSS buferšķīdumu un inkubēja ar Hoechst HBSS buferšķīdumā istabas temperatūrā.minūtes.Doksorubicīns tika izmantots kā pozitīva zondes kontrole, kur šūnas 30 minūtes apstrādāja ar 20 μM doksorubicīnu HBSS, kas satur 1% BSA.Imunofluorescējošie attēli tika iegūti, izmantojot Zeiss LSM 900 konfokālo mikroskopu.
HEK293T šūnas, kas stabili ekspresē mito-miniSOG, tika iesētas aptuveni 30% blīvumā 15 cm traukos.Pēc 48 stundām, kad tika sasniegta ~ 80% saplūšana, šūnas vienu reizi mazgāja ar PBS, inkubēja ar 1 mM zondi 3 svaigā HBSS buferšķīdumā 1 stundu 37 ° C temperatūrā un pēc tam 10 minūtes telpā izgaismoja ar zilu LED. temperatūra..Pēc tam šūnas divas reizes nomazgāja ar PBS, nokasīja un atkārtoti suspendēja ledus aukstā PBS buferšķīdumā, kas satur proteāzes inhibitorus, kas nesatur EDTA (MCE, #HY-K0011).Šūnas tika lizētas, 1 minūti apstrādājot galu ar ultraskaņu (1 sekunde ieslēgta un 1 sekunde izslēgta ar 35% amplitūdu).Iegūtais maisījums tika centrifugēts ar ātrumu 15 871 xg 10 minūtes 4 ° C temperatūrā, lai noņemtu gružus, un supernatanta koncentrāciju noregulēja uz 4 mg / ml, izmantojot BCA proteīna testa komplektu (Beyotime, # P0009).Apvienojiet 1 ml iepriekš minētā lizāta ar 0,1 mM fotodegradējamo biotīna azīdu (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligandu (Aladdin, #T162437) un 1 mM CuSO4 inkubatoru ar apakšējo inkubatoru. griež uz augšu 1 stundu istabas temperatūrā.Pēc ātras reakcijas pievienojiet maisījumu iepriekš sajauktajam šķīdumam (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) 10 ml stikla flakonā.Paraugus sajauca un centrifugēja pie 4500 g 10 minūtes istabas temperatūrā.Apakšējais un augšējais šķīdums tika izmests, nogulsnes divas reizes nomazgāja ar 1 ml metanola un centrifugēja ar ātrumu 15871 × g 5 minūtes 4 ° C temperatūrā.Pievienojiet 1 ml 8 M urīnvielas (Aladdin, Nr. U111902) 25 mM amonija bikarbonātā (ABC, Aladdin, Nr. A110539), lai izšķīdinātu nogulsnes.Paraugus atšķaida ar 10 mM ditiotreitolu (Sangon, #A100281 25 mM ABC) 40 minūtes 55 °C temperatūrā, kam sekoja 15 mM svaiga jodacetamīda (Sangona, #A600539) pievienošana istabas temperatūrā tumsā.Alkilēšana 30 minūšu laikā..Lai apturētu reakciju, pievienoja papildu 5 mM ditiotreitolu.Katram paraugam sagatavo apmēram 100 µl NeutrAvidin agarozes lodītes (Thermo, #29202), mazgājot 3 reizes ar 1 ml PBS.Iepriekš minētais proteomu šķīdums tika atšķaidīts ar 5 ml PBS un inkubēts ar iepriekš mazgātām NeutrAvidin agarozes lodītēm 4 stundas istabas temperatūrā.Pēc tam lodītes 3 reizes mazgāja ar 5 ml PBS, kas satur 0, 2% SDS (Sangon, # A600485), 3 reizes ar 5 ml PBS, kas satur 1 M urīnvielu, un 3 reizes ar 5 ml ddH2O.Pēc tam lodītes tika novāktas, centrifugējot un atkārtoti suspendētas 200 μl 25 mM ABC, kas satur 1 M urīnvielu, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) un 20 ng/μl tripsīna (Promega, # V5280).Tripsinizēt nakti 37°C ar rotāciju.Reakcija tika apturēta, pievienojot skudrskābi (Thermo, # A117-50), līdz pH sasniedza 2-3.Pērlītes tika mazgātas 3 reizes ar 1 ml PBS, kas satur 0, 2% SDS, 3 reizes ar 1 ml PBS, kas satur 1 M urīnvielu, un pēc tam 3 reizes ar 1 ml destilēta ūdens.Modificētie peptīdi tika atbrīvoti ar vieglu līzi (365 nm) 90 minūtes, izmantojot 200 μl 70% MeOH.Pēc centrifugēšanas supernatants tika savākts.Pēc tam lodītes vienu reizi nomazgāja ar 100 μl 70% MeOH, un supernatanti tika apvienoti.Paraugi tika žāvēti Speedvac vakuuma koncentratorā un uzglabāti -20 ° C temperatūrā līdz analīzei.
Lai identificētu un kvantitatīvi noteiktu ar skābekli modificēto viengabala peptīdus, paraugi tika atkārtoti izšķīdināti 0, 1% skudrskābē un 1 μg peptīdu tika analizēti, izmantojot Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masas spektrometru, kas aprīkots ar nano ESI avotu no Tune un Xcalibur no pārdevēja programmatūras 4.3.Paraugi tika atdalīti uz 75 µm × 15 cm iekšēji pildītas kapilārās kolonnas ar 3 µm C18 materiālu (ReproSil-pur, #r13.b9.) un savienoti ar EASY-nLC 1200 UHPLC sistēmu (Thermo).Peptīdi tika atdalīti ar lineāru 95 minūšu gradienta hromatogrāfiju no 8% šķīdinātāja B līdz 50% šķīdinātājam B (A = 0,1% skudrskābe ūdenī, B = 0,1% skudrskābe 80% acetonitrilā), pēc tam lineāri palielināja līdz 98% B min. 6 minūtēs ar plūsmas ātrumu 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos atkarībā no datiem apkopo datus pārmaiņus starp pilnu MS skenēšanu un MS2 skenēšanu.Izsmidzināšanas spriegums tika iestatīts uz 2, 1 kV, un jonu transportēšanas kapilāra temperatūra bija 320 ° C.MS spektri (350-2000 m/z) tika savākti ar izšķirtspēju 120 000, AGC 4 × 105 un maksimālo ievades laiku 150 ms.10 visizplatītākie daudzkārt uzlādētie prekursori katrā pilnajā skenē tika sadrumstaloti, izmantojot HCD ar normalizētu sadursmes enerģiju 30%, kvadrupola izolācijas logu 1, 6 m/z un izšķirtspējas iestatījumu 30 000.AGC mērķis tandēma masas spektrometrijai, izmantojot 5 × 104 un maksimālo ievades laiku 150 ms.Dinamiskais izņēmums ir iestatīts uz 30 sekundēm. Nepiešķirtie joni vai tie, kuru lādiņš ir 1+ un >7+, tika noraidīti attiecībā uz MS/MS. Nepiešķirtie joni vai tie, kuru lādiņš ir 1+ un >7+, tika noraidīti attiecībā uz MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nepiešķirtie joni vai joni ar lādiņu 1+ un >7+ tika noraidīti attiecībā uz MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Neprecizēti joni vai joni ar lādiņiem 1+ un >7+ tika noraidīti attiecībā uz MS/MS.
Neapstrādātie dati tiek apstrādāti, izmantojot FragPipe skaitļošanas platformu, kuras pamatā ir MSFragger.Masas novirzes un atbilstošās aminoskābes tika noteiktas, izmantojot atvērtu meklēšanas algoritmu ar prekursora masas pielaidi no -150 līdz 500 Da.Pēc tam modificētie peptīdi tika identificēti, izmantojot histidīna modifikācijas ar masas pieaugumu +229,0964 un +247,1069 Da PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Šūnas, kas stabili ekspresē sapludināto miniSOG gēnu, tika izklātas 6 cm traukos.Sasniedzot ~ 80% saplūšanu, šūnas vienu reizi nomazgāja ar HBSS (Gibco, # 14025092), pēc tam inkubēja ar ķīmiskajām zondēm HBSS 1 stundu 37 ° C temperatūrā un apgaismoja ar zilu gaismu.10W LED 20 minūtes istabas temperatūrā.Lai noteiktu, kāda veida reaktīvās skābekļa sugas ir iesaistītas PDPL, 0,5 mM C vitamīns (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Kā piedevas šūnām tika pievienots 100 mM mannīts (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3.Pēc mazgāšanas ar aukstu PBS šūnas tika nokasītas, savāktas 1, 5 ml centrifūgas mēģenēs un 1 minūti apstrādātas ar ultraskaņu ar galu 200 μl PBS ar 1x proteāzes inhibitoru bez EDTA (1 s un 1 s bez, amplitūda 35%).Iegūtais maisījums tika centrifugēts ar ātrumu 15 871 × g 10 minūtes 4 ° C temperatūrā, un supernatanta koncentrācija tika noregulēta līdz 1 mg / ml, izmantojot BCA proteīna testa komplektu.Aptuveni 50 µl iepriekš minētā lizāta tika inkubēti ar 0,1 mM rodamīna azīdu (Aladdin, Nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandu un 1 mM CuSO4 1 stundu istabas temperatūrā, griežot no apakšas uz augšu.Pēc klikšķa reakcijas tika veikta izgulsnēšana ar acetonu, pievienojot paraugiem 250 μl iepriekš atdzesēta acetona, inkubējot -20 ° C temperatūrā 20 minūtes un centrifugējot ar ātrumu 6010 × g 10 minūtes 4 ° C temperatūrā.Savāc granulu un vāra 50 µl 1x Laemmli buferšķīduma 10 minūtes 95 °C temperatūrā.Pēc tam paraugi tika analizēti uz SDS-PAGE gariem gēliem un vizualizēti, izmantojot Bio-rad ChemiDoc MP Touch attēlveidošanas sistēmu ar Image Lab Touch programmatūru.
Rekombinantā miniSOG-6xHis proteīna ekspresija un attīrīšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš.Īsumā, E. coli BL21(DE3) šūnas (TransGen, #CD701-02) tika transformētas ar pET21a-miniSOG-6xHis un proteīna ekspresija tika ierosināta ar 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Pēc šūnu līzes olbaltumvielas tika attīrītas, izmantojot Ni-NTA agarozes lodītes (MCE, Nr. 70666), dializētas pret PBS un uzglabātas –80°C.
Lai veiktu uz antivielām balstītu in vitro marķējuma tuvuma testu, sajauciet 100 μM attīrītu miniSOG, 1 mM zondi 3 un 1 μg anti-iezīmēšanas peles monoklonālās antivielas (TransGen, #HT501-01) PBS līdz kopējam reakcijas tilpumam 50 μl..Reakcijas maisījumu apstaroja ar zilu LED gaismu 0, 2, 5, 10 un 20 minūtes istabas temperatūrā.Maisījumu inkubēja ar 0,1 mM biotīna-PEG3-azīdu (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandu un 1 mM CuSO4 1 stundu istabas temperatūrā uz augšupvērstas kustības kratītāja.Pēc ātras reakcijas pievienojiet 4x Laemmli buferšķīdumu tieši maisījumam un vāriet 95°C 10 minūtes.Paraugus analizēja uz SDS-PAGE gēliem un analizēja ar Western blot metodi ar streptavidīnu-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Histidīnu saturošs sintētisks peptīds ar C-gala amidāciju (LHDALDAK-CONH2) tika izmantots, lai analizētu tuvējo uz peptīdu balstītu in vitro marķēšanu.Šajā testā 100 μM attīrīta miniSOG, 10 mM zondes 3 un 2 μg/ml sintētiskā peptīda tika sajaukti PBS ar kopējo reakcijas tilpumu 50 μl.Reakcijas maisījumu 1 stundu istabas temperatūrā apstaroja ar zilu LED gaismu.Viens mikrolitrs parauga tika analizēts, izmantojot LC-MS sistēmu (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight masas spektrometru ar MassLynx spektra analīzes programmatūru).
HEK293T šūnas, kas stabili ekspresē miniSOG saplūšanas gēnu, tika iesētas 10 cm trauciņos līnijām ar dažādu organellu lokalizāciju (Mito, ER, Nucleus) un 15 cm traukos Parkin-miniSOG un BRD4-miniSOG līnijām.Sasniedzot ~ 90% saplūšanu, šūnas vienu reizi nomazgāja ar HBSS, pēc tam inkubēja ar zondi 3 HBSS 1 stundu 37 ° C temperatūrā un istabas temperatūrā apgaismoja ar 10 W zilu LED.Parkin bezkontakta marķēšanai pievienoja 10 µM protonu karbonilcianīda nesēju m-hlorfenilhidrazona CCCP (Solarbio, #C6700) ar zondi 3 HBSS uz 1 stundu 37 °C temperatūrā.Šūnu līzes, klikšķu ķīmijas, reducēšanas un alkilēšanas posmi bija tādi paši, kā aprakstīts iepriekš, izņemot to, ka tika pievienoti 2 mg lizāta un klikšķa reakcijā tika izmantots biotīna PEG3 azīds, nevis fotodegradējams biotīna azīds.Pēc bagātināšanas lodītes 3 reizes mazgāja ar 5 ml PBS, kas satur 0, 2% SDS, 3 reizes ar 5 ml PBS, kas satur 1 M urīnvielu, un 3 reizes ar 5 ml PBS.Pēc tam 2 µg tripsīna pievienoja 300 µl 25 mM ABC, kas satur 1 M urīnvielu, lai šķeltu proteīnu nakti 37 ° C temperatūrā.Reakciju apturēja, pievienojot skudrskābi, līdz tika sasniegts pH 2-3.Pēc tripsinizācijas uz lodītēm peptīda šķīdums tika atsālīts, izmantojot SOLAµ HRP kolonnu (Thermo, # 60209-001) un žāvēts Speedvac vakuuma koncentratorā.Peptīdi tika atkārtoti izšķīdināti 0, 1% skudrskābē, un 500 ng peptīdu tika analizēti, izmantojot Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masas spektrometru, kas aprīkots ar iepriekš aprakstīto nano-ESI avotu.Peptīdi tika atdalīti uz komerciālām RP-HPLC priekškolonnām (75 μm x 2 cm) (Thermo, Nr. 164946) un analītiskajām RP-HPLC kolonnām (75 μm x 25 cm) (Thermo, Nr. 164941), abas bija piepildītas ar 2 μm.gradients no 8% līdz 35% ACN 60 minūtēs, pēc tam lineāri palielināts līdz 98% B 6 minūtēs ar plūsmas ātrumu 300 Nl/min.MS spektri (350-1500 m/z) tika savākti ar izšķirtspēju 60 000, AGC 4 × 105 un maksimālo ievades laiku 50 ms.Atlasītie joni tika secīgi fragmentēti ar HCD 3 sekunžu ciklos ar normalizētu sadursmes enerģiju 30%, kvadrupola izolācijas logu 1,6 m/z un izšķirtspēju 15000. 5 × 104 tandēma masas spektrometra AGC mērķis un maksimālais injekcijas laiks tika izmantoti 22 ms.Dinamiskā izslēgšana ir iestatīta uz 45 sekundēm. Nepiešķirtie joni vai tie, kuru lādiņš ir 1+ un >7+, tika noraidīti attiecībā uz MS/MS. Nepiešķirtie joni vai tie, kuru lādiņš ir 1+ un >7+, tika noraidīti attiecībā uz MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nepiešķirtie joni vai joni ar lādiņu 1+ un >7+ tika noraidīti attiecībā uz MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Neprecizēti joni vai joni ar lādiņiem 1+ un >7+ tika noraidīti attiecībā uz MS/MS.
Parauga sagatavošanas soļi līdz NeutrAvidin lodīšu bagātināšanai bija tādi paši kā iepriekš aprakstītajā LC-MS/MS analīzē.Aptuveni 50 μg lizāta tika izmantoti kā ievade iekraušanas kontrolei un 2 mg lizāta tika izmantoti klikšķu reakcijām.Pēc bagātināšanas un mazgāšanas ar neitravidīnu saistītie proteīni tika eluēti, agarozes sveķu lodītēm pievienojot 50 μl Laemmli buferšķīduma un vārot 95 °C temperatūrā 5 minūtes.Kontroles slodzes ievade un lodītes bagātinātie paraugi tika analizēti ar SDS-PAGE un pārnesti uz PVDF membrānām (Millipore, #ISEQ00010) ar standarta Western blot metodēm.Membrānas tika bloķētas ar 5% vājpienu (Sangon, #A600669) TBS, kas satur 0, 1% Tween-20 (TBST), un secīgi inkubēja ar primārajām un sekundārajām antivielām.Primārās antivielas tika atšķaidītas 1:1000 5% vājpienā TBST un inkubētas nakti 4 ° C temperatūrā.Sekundārās antivielas tika izmantotas attiecībā 1:5000 un inkubētas 1 stundu istabas temperatūrā.Membrānas tika vizualizētas ar hemiluminiscenci, izmantojot Chemidoc MP attēlveidošanas sistēmu.Visi neizgrieztie blotu un želeju skenējumi attēlā ir parādīti kā neapstrādāti dati.
Šajā pētījumā izmantotās primārās antivielas ietvēra trušu anti-SFPQ monoklonālo antivielu (CST, Nr. 71992), trušu anti-FUS monoklonālo antivielu (CST, Nr. 67840), trušu anti-NSUN2 poliklonālo antivielu (Proteintech, Nr. 20854-1-). AP), trušu anti-mSin3A poliklonālā antiviela (Abcam, #ab3479), peles anti-tag monoklonālā antiviela (TransGen, #HT201-02), peles anti-β-aktīna monoklonālā antiviela (TransGen, #HC201-01), truša antiviela -CDK2 monoklonālā antiviela (ABclonal, #A0094), truša monoklonālā antiviela pret CTBP1 (ABclonal, #A11600), truša poliklonālā antiviela pret DUT (ABclonal, #A2901), trušu poliklonālā antiviela pret PSMC4 (ABclonal, #A2 anti-05), #A2 anti-05 DNAJB1 poliklonālā antiviela (ABclonal, # A5504).Šīs antivielas tika izmantotas 1:1000 atšķaidījumā 5% vājpiena TBST.Šajā pētījumā izmantotās sekundārās antivielas ietvēra anti-trušu IgG (TransGen, #HS101-01), anti-peles IgG (TransGen, #HS201-01) atšķaidījumā 1:5000.
Lai turpinātu izpētīt, vai BRD4 mijiedarbojas ar SFPQ, stabilas HEK293T un BRD4-miniSOG šūnas, kas pārmērīgi ekspresē HEK293T, tika izklātas 10 cm traukos.Šūnas tika mazgātas ar aukstu PBS un lizētas 1 ml Pierce IP līzes buferšķīdumā (Thermo Fisher, #87787) ar proteāzes inhibitoru, kas nesatur EDTA, 30 minūtes 4 ° C temperatūrā.Pēc tam lizāti tika savākti 1, 5 ml centrifūgas mēģenēs un centrifugēti ar ātrumu 15 871 xg 10 minūtes 4 ° C temperatūrā.Supernatants tika novākts un inkubēts ar 5 µg anti-V5 iezīmētas peles monoklonālās antivielas (CST, #80076) nakti 4 °C temperatūrā.Divreiz nomazgājiet aptuveni 50 µl proteīna A/G magnētisko lodīšu (MCE, #HY-K0202) ar PBS, kas satur 0,5% Tween-20.Pēc tam šūnu lizātus inkubēja ar magnētiskām lodītēm 4 stundas 4 ° C temperatūrā, griežot no apakšas uz augšu.Pēc tam lodītes četras reizes mazgāja ar 1 ml PBST buferšķīduma un vārīja 95 ° C temperatūrā 5 minūtes.Paraugi tika analizēti uz SDS-PAGE gēliem un pārnesti uz PVDF membrānām, izmantojot standarta Western blot metodes.Membrānas tika bloķētas 5% vājpienā TBST un secīgi inkubētas ar primārajām un sekundārajām antivielām.Primārā antiviela Trušu anti-SFPQ monoklonālā antiviela (CST, #71992) tika izmantota attiecībā 1:1000 5% vājpienā TBST un inkubēta nakti 4 °C temperatūrā.Anti-trušu IgG tika izmantots attiecībā 1:5000 un inkubēts 1 stundu istabas temperatūrā.Membrānas tika vizualizētas ar hemiluminiscenci, izmantojot Chemidoc MP attēlveidošanas sistēmu.
Visas struktūras, kas izmantotas šķīdinātāju pieejamās virsmas laukuma (SASA) analīzei, tika iegūtas no proteīnu datu bankas (PDB)52 vai AlphaFold proteīnu struktūru datu bāzes53.Absolūtais SASA tika aprēķināts katram atlikumam, izmantojot programmu FreeSASA.Lai iegūtu vidējo SASA katrai struktūrai, tika izmantoti tikai pilnīgi un nepārprotami SASA dati par marķēto histidīnu un tā kaimiņiem.Katra histidīna relatīvā šķīdinātāja pieejamība (RSA) tika aprēķināta, dalot absolūto SASA vērtību ar empīriski maksimālo iespējamo atlieku virsmas laukumu, kas pieejams šķīdinātājam.Pēc tam visi histidīni tika klasificēti kā slēpti, ja vidējais RSA bija zem 20%, pretējā gadījumā tika pakļauti56.
Neapstrādāti faili, kas iegūti DDA režīmā, tika meklēti, izmantojot Proteome Discoverer (v2.5) vai MSfragger (Fragpipe v15.0) attiecīgajā SwissProt pārbaudītajā proteīnu datubāzē, kurā bija izplatīti piesārņotāji.Peptīdiem bija nepieciešams pilnīgs tripsīns ar divām trūkstošām šķelšanās vietām, karbamoilmetilēšana kā fiksēta modifikācija un metionīna oksidēšana kā dinamiska modifikācija.Prekursoru un fragmentu svara pielaides tika iestatītas attiecīgi uz 10 ppm un 0, 02 Da (MS2 Orbitrap). Piesārņotāju trāpījumi tika noņemti, un olbaltumvielas tika filtrētas, lai iegūtu viltus atklāšanas līmeni <1%. Piesārņotāju trāpījumi tika noņemti, un olbaltumvielas tika filtrētas, lai iegūtu viltus atklāšanas līmeni <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфнифщих коэфнифулио%. Piesārņojuma trāpījumi tika noņemti un olbaltumvielas filtrētas, lai viltus noteikšanas rādītājs būtu <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложниных1 ложнины%. Piesārņojuma trāpījumi tika noņemti un olbaltumvielas filtrētas, lai iegūtu kļūdaini pozitīvu rezultātu <1%.Kvantitatīvai analīzei, neizmantojot etiķetes, tika izmantots normalizēts olbaltumvielu saturs no trim bioloģiskiem atkārtojumiem.Olbaltumvielu subcelulārās lokalizācijas analīze tika veikta, izmantojot Gene Ontology (GO) analīzi no DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 un datubāzēm, kuras apkopoja un publicēja Alice Ting grupa.Vulkāna karte tika iegūta no Perseus (v1.6.15.0). Olbaltumvielu daudzuma izmaiņu statistiskais nozīmīgums tika pārbaudīts, izmantojot divpusēju t-testu, un proteīnu trāpījumi tika identificēti ar pārpilnības izmaiņām> 2 (ja nav norādīts citādi) un p vērtību <0, 05. Olbaltumvielu daudzuma izmaiņu statistiskais nozīmīgums tika pārbaudīts, izmantojot divpusēju t-testu, un proteīnu trāpījumi tika identificēti ar pārpilnības izmaiņām> 2 (ja nav norādīts citādi) un p vērtību <0, 05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Olbaltumvielu satura izmaiņu statistiskais nozīmīgums tika pārbaudīts, izmantojot divpusēju t-testu, un olbaltumvielu atbilstības tika identificētas ar satura izmaiņām> 2 (ja nav norādīts citādi) un ap vērtību <0, 05.使用 双边 t 检验 测试 丰度 丰度 倍数 变化 的 统计 ， ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Olbaltumvielu satura izmaiņu statistiskā nozīme tika pārbaudīta, izmantojot divpusēju t-testu, un tika noteiktas olbaltumvielu atbilstības satura izmaiņām> 2 (ja nav norādīts citādi) un p-vērtībām <0,05.Olbaltumvielu mijiedarbības analīze tika veikta, izmantojot GO analīzi kopā ar String datu bāzi.
Tika veikti trīs bioloģiskie atkārtojumi ar līdzīgiem rezultātiem.Statistiskā analīze tika veikta ar GraphPad Prism (programmatūra GraphPad), un vulkānu diagrammas tika ģenerētas ar Perseus (v1.6.15.0).Lai salīdzinātu abas grupas, p vērtības tika noteiktas, izmantojot divpusējo Studenta t-testu.Vulkānu diagrammās tika iekļauti tikai atsevišķie proteīni, kas eksperimentālajā grupā identificēti vismaz divas reizes, un atbilstošās trūkstošās vērtības kontroles grupā tika aizstātas ar Perseus no normāla sadalījuma, lai varētu aprēķināt p vērtību.Kļūdu joslas attēlo vidējo ± standarta novirzi.Statistiskās analīzes proteomiskajās analīzēs tika saglabāts proteīnu pārpilnība, kas parādījās vismaz divos bioloģiskos atkārtojumos.Statistikas metodes netika izmantotas, lai iepriekš noteiktu izlases lielumu.Eksperimenti nav nejauši.Eksperimenta un rezultātu izvērtēšanas laikā pētnieki nebija akli pret uzdevumiem.
Lai iegūtu papildinformāciju par studiju plānošanu, skatiet dabas pētījumu ziņojuma kopsavilkumu, kas ir saistīts ar šo rakstu.
Šajā pētījumā iegūtie masas spektrometrijas dati tika iesniegti ProteomeXchange konsorcijam, izmantojot iProX57 partneru repozitoriju ar datu kopas ID PXD034811 (PDPL-MS datu kopa).Neapstrādāti dati tiek nodrošināti neapstrādātu datu failu veidā.Šajā rakstā ir sniegti sākotnējie dati.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Apkārtnes iepazīšana: no tuvuma atkarīgas biotinilācijas izmantošana proteīnu kompleksu raksturošanai un organellu kartēšanai. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Apkārtnes iepazīšana: no tuvuma atkarīgas biotinilācijas izmantošana proteīnu kompleksu raksturošanai un organellu kartēšanai.Gingras, AS, Abe, KT un Raut, B. Iepazīšanās ar apkārtni: izmantojot tuvuma atkarīgu biotinilāciju, lai raksturotu proteīnu kompleksus un kartētu organellus. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征盋白质复征蛋白质复嶐物 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Izpratne par apkārtni: izmantojiet apkārtnes atkarību no bioloģiskās dzīves.Gingras, AS, Abe, KT un Raut, B. Izpratne par tuvumu: proteīnu kompleksu raksturojums un organellu kartēšana, izmantojot no tuvuma atkarīgu biotinilāciju.Pašreizējais.Mans viedoklis.Ķīmiskā.bioloģija 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Mikrovides kartēšana, pārnesot Dekstera enerģiju imūnās šūnās.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertlings, EL et al.Divu proteomu mēroga tīkli atklāj šūnām raksturīgu cilvēka mijiedarbības remodelāciju.Šūnas 184, 3022–3040.e3028 (2021).