Jaunumi

Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Vēža šūnas ir attīstījušas dažādus mehānismus, lai pārvarētu šūnu stresu un turpinātu progresēt.Proteīna kināze R (PKR) un tās proteīna aktivators (PACT) ir sākotnējie reaģētāji, kas uzrauga dažādus stresa signālus, kas izraisa šūnu proliferācijas un apoptozes kavēšanu.Tomēr PACT-PKR ceļa regulēšana vēža šūnās joprojām nav zināma.Šeit mēs noskaidrojām, ka gara nekodējoša RNS (lncRNS) aspartil-tRNS sintetāzes antisense RNS 1 (DARS-AS1) ir tieši iesaistīta PACT-PKR ceļa inhibēšanā un veicina vēža šūnu proliferāciju.Izmantojot CRISPRi 971 ar vēzi saistītās lncRNS liela mēroga funkcionālo skrīningu, mēs noskaidrojām, ka DARS-AS1 bija saistīta ar ievērojami uzlabotu vēža šūnu proliferāciju.Tāpēc DARS-AS1 knockout inhibē šūnu proliferāciju un veicina vēža šūnu apoptozi dažādās vēža šūnu līnijās in vitro un ievērojami samazina audzēja augšanu in vivo .Mehāniski DARS-AS1 saistās tieši ar PACT aktivācijas domēnu un novērš PACT-PKR mijiedarbību, tādējādi samazinot PKR aktivāciju, eIF2α fosforilāciju un kavējot apoptotisko šūnu nāvi.Klīniski DARS-AS1 ir plaši izteikts vairākos vēža veidos, un šīs lncRNS pārmērīga ekspresija liecina par sliktu prognozi.Šis pētījums izskaidro PACT-PKR ceļa vēža specifisko regulējumu ar DARS-AS1 lncRNS un nodrošina vēl vienu mērķi vēža prognozēšanai un ārstēšanai.
Spēja pielāgoties stresam ir svarīga vēža šūnu izdzīvošanas un proliferācijas īpašība.Vēža straujā proliferācija un vielmaiņas pazīmes sasniedz maksimumu skarbos mikrovidēs - barības vielu trūkuma, hipoksijas un zemā pH gadījumā -, kas var izraisīt šūnu nāves signālu ceļus.Vēža gadījumā bieži tiek novērota stresa jutīgu gēnu, piemēram, p535, karstuma šoka proteīnu 6, 7, KRAS8, 9 un HIF-110, 11, 12, 13, disregulācija, tādējādi bloķējot apoptozi un veicinot izdzīvošanu.
Proteīna kināze R (PKR) ir svarīgs stresa sensors un eikariotu iniciācijas faktora 2α (eIF2α) apakšvienības kināze, translācijas regulators, kas saista šūnu stresu ar šūnu nāvi.Sākotnēji PKR tika identificēts kā pretvīrusu proteīns, atklājot svešu divpavedienu RNS (dsRNS).Pēc aktivizēšanas PKR fosforilē eIF2α, lai kavētu vīrusu un šūnu proteīnu sintēzi 14, 15, 16.PACT (PKR aktivatora proteīns) ir identificēts kā pirmais PKR aktivatora proteīns, ja nav dsRNS17,18,19,20,21,22,23.Tiešā mijiedarbībā ar PKR, PACT pārveido dažādus spriegumus (seruma badu, apstrādi ar peroksīdu vai arsenītu) uz PKR un pakārtotajiem signalizācijas ceļiem.Papildus eIF2α fosforilēšanai, PACT mediētā PKR aktivācija izraisa dažādus notikumus, kas saistīti ar stresa reakciju, tostarp mainīts redoksa statuss, izmantojot PI3K/Akt24 ceļu, pastiprināta DNS bojājumu pārbaude, izmantojot p5325,26 un NF-κB27,28 Regulē transkripciju, 29. Ņemot vērā to kritisko lomu stresa reakcijā, proliferācijā, apoptozē un citos galvenajos šūnu procesos, PKR un PACT ir daudzsološi terapeitiskie mērķi daudzām slimībām, īpaši vēzim30, 31, 32, 33.Tomēr, neskatoties uz šo pleiotropo funkcionālo un bioloģisko nozīmi, PACT / PKR aktivitātes regulēšana vēža šūnās joprojām ir nenotverama.
lncRNS ir transkripti, kas lielāki par 200 nukleotīdiem un kuriem nav proteīnu kodēšanas potenciāla.Tā kā visprogresīvākie visa genoma sekvencēšanas projekti ir identificējuši tūkstošiem lncRNS35, 36, ir pieliktas lielas pūles, lai noskaidrotu to bioloģiskās funkcijas.Arvien vairāk pētījumu ir parādījuši, ka lncRNS ir iesaistītas daudzos bioloģiskos procesos37, tostarp X-hromosomu inaktivācijas regulēšanā38,39, nospiedumu veidošanā40, transkripcijā41,42, translācijā43 un pat vēža augšanā44,45,46,47.Šie pētījumi ziņoja, ka daudzas lncRNS ir iesaistītas PACT / PKR ceļā.Viens no šādiem pētījumiem parādīja, ka lncRNA ASPACT inhibēja PACT transkripciju un palielināja PACT mRNS kodola aizturi.Citi pētījumi ir parādījuši, ka lncRNS nc886 saistās ar PKR un inhibē tā fosforilēšanos49,50.Līdz šim nav ziņots par lncRNS, kas regulē PACT mediētu PKR aktivāciju.
Aspartil-tRNS sintetāzes antisense RNS 1 (DARS-AS1) ir identificēta kā onkogēna lncRNS51, 52, 53, 54.Ir pierādīts, ka, regulējot miP-194-5p53, miP-12952 un miP-532-3p51, DARS-AS1 veicina skaidru šūnu nieru šūnu karcinomas, vairogdziedzera karcinomas un nesīkšūnu plaušu karcinomas augšanu.Tongs un kolēģi arī atklāja, ka DARS-AS1 veicina mielomas progresēšanu, saglabājot proteīna 39 (RBM39) RNS saistošā motīva stabilitāti.Tomēr nav veikti pētījumi par to, vai šī lncRNS ir iesaistīta PACT-PKR aktivācijas un vēža šūnu stresa reakcijas regulēšanā.
Šeit mēs veicām liela mēroga funkciju zaudēšanas ekrānu, izmantojot CRISPRi sistēmu, un noskaidrojām, ka DARS-AS1 lncRNS veicina vairāku veidu vēža šūnu proliferāciju.Turklāt mēs esam identificējuši galveno mehānismu: DARS-AS1 saistās tieši ar PACT, inhibē PACT un PKR saistīšanos, novērš eIF2α, zemāka PKR substrāta, fosforilēšanos un galu galā kavē apoptotisko šūnu nāvi.Noslēgumā jāsaka, ka mūsu darbs atklāj DARS-AS1 lncRNS kā PACT-PKR ceļa regulatoru un potenciālu vēža ārstēšanas un prognozes mērķi.
Plaši genoma profilēšanas pētījumi ir identificējuši simtiem lncRNS, kas saistīti ar vēzi.Tomēr to funkcija joprojām lielā mērā nav zināma56.Lai identificētu daudzsološus lncRNS kandidātus, kas iesaistīti vēža progresēšanā, mēs veicām funkciju zuduma skrīningu, lai samazinātu proliferāciju SW620 kolorektālā vēža šūnu līnijā, izmantojot CRISPRi sistēmu (1.a att.).SW480 un SW620 resnās zarnas vēža šūnu līniju unikālā iezīme ir tā, ka tās ir iegūtas no viena pacienta primārajiem un sekundārajiem audzējiem.Tas nodrošina vērtīgu salīdzinājumu progresējoša resnās zarnas vēža progresēšanas ģenētisko izmaiņu pētīšanai.Tāpēc mēs analizējām kolorektālā vēža šūnu līniju (SW480 un SW620) transkriptus, izmantojot RNS sekvencēšanu, un apkopojām dažas iespējamās funkcionālās lncRNS no publicētās literatūras.Pamatojoties uz šiem rezultātiem, mēs izstrādājām apvienotu sgRNS bibliotēku, kas satur 7355 sgRNS oligo, kas vērstas uz 971 ar vēzi saistītu lncRNS un 500 nemērķētu sgRNS oligo negatīvai kontrolei (1. papildu dati).
Skrīninga shematisks attēlojums, izmantojot CRISPRi sistēmu.b sgRNS bagātināšana pēc skrīninga.Horizontālā punktētā līnija apzīmē log2 (reizes izmaiņas) = ​​±0,58.Vertikālā punktētā līnija norāda p vērtību = 0,05.Melni punkti apzīmē nemērķa sgRNS (apzīmēta kā NC).Sarkanie punkti ir sgRNS, kuru mērķauditorija ir DARS-AS1.Zilie punkti ir sgRNS, kuru mērķauditorija ir LINC00205, kas ir iepriekš aprakstīta onkogēna lncRNS.locījuma maiņa = (normalizēts rādījums, 17. diena)/(normalizēts rādījums, 0. diena).c DARS-AS1 sgRNS notriekšana kavēja šūnu augšanu.Kļūdu joslas attēlo ± trīs eksperimentu standarta novirzi.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 divpusējs Stjudenta t-tests.d DARS-AS1 ekspresija audzējos (TCGA datu kopa).em DARS-AS1 ekspresija pāru normālos un audzēju paraugos no pacientiem ar attiecīgi BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP un COAD (TCGA datu kopa).p-vērtības tika iegūtas, izmantojot pāra divpusējo Studenta t-testu.
Pēc plazmīdas konstruēšanas un lentivīrusa iepakošanas mēs četros neatkarīgos infekcijas eksperimentos transducējām dCas9-SW620 kolorektālā vēža šūnu līniju ar iepriekš minēto bibliotēku.Šo infekciju infekcijas biežums (MOI) bija 0, 1–0, 3, kas norāda, ka katru šūnu var transficēt tikai ar vienu sgRNS.Pēc 18 dienu ilgas in vitro kultivēšanas mērķa sgRNS bagātināšanas profils pēc skrīninga samazinājās vai palielinājās, savukārt nemērķtiecīgo kontroles oligonukleotīdu skaits palika relatīvi nemainīgs, salīdzinot ar pirmsskrīninga profilu, norādot, ka mūsu mērķim ir ļoti specifisks ekrāns. bibliotēka.Rīsi.1.b un 1. papildtabulu). LINC00205, par kuru iepriekš ziņots, ka tas veicina plaušu vēža un aknu vēža progresēšanu58, 59, 60, tika pārbaudīts (log2 (izmaiņas reizes) < –0,58, p vērtība < 0,05), apstiprinot šī skrīninga ticamību (1.b attēls). LINC00205, par kuru iepriekš ziņots, ka tas veicina plaušu vēža un aknu vēža progresēšanu58, 59, 60, tika pārbaudīts (log2 (izmaiņas reizes) < –0,58, p vērtība < 0,05), apstiprinot šī skrīninga ticamību (1.b attēls). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, par kuru iepriekš ziņots, ka tas veicina plaušu vēža un aknu vēža progresēšanu58, 59, 60, tika izslēgts (log2 (izmaiņas reizes) <-0,58, p-vērtība <0,05), apstiprinot šī skrīninga noturību (1.b attēls). . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 该 该 筛选 可靠性 可靠性 （图 1B）。。 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （（图 1B）。。。 证实 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 （图 图 1B）。。 证实 证实 该 该 筛选 的 可靠性 （（图 1 Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 该 该 筛选 可靠性 可靠性 （图 1B）。。 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （（图 1B）。。。 证实 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 （图 图 1B）。。 证实 证实 该 该 筛选 的 可靠性 （（图 1 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, par kuru iepriekš ziņots, ka tas veicina plaušu un aknu vēža progresēšanu58,59,60, tika izslēgts (log2 (izmaiņas reizes) <-0,58, p-vērtība <0,05), apstiprinot šī skrīninga noturību (1.b attēls).
No visām pārbaudītajām lncRNS tika pārbaudīts arī DARS-AS1, un trīs radniecīgie sgRNS oligonukleotīdi pēc 18 dienu kultivēšanas ievērojami samazinājās, kas liecina, ka šīs lncRNS iznīcināšana izraisīja vēža proliferācijas samazināšanos (1.b attēls).Šo rezultātu vēl vairāk apstiprināja MTS analīze kolorektālā vēža šūnās, parādot, ka DARS-AS1 knockdown šūnu augšanas ātrums tika samazināts tikai uz pusi, salīdzinot ar kontroles šūnām (1.c attēls), un tas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem par vairākiem citiem vēža veidiem.: skaidru šūnu nieru vēzis, vairogdziedzera vēzis un nesīkšūnu plaušu vēzis51,52,53,55.Tomēr tā funkcija un molekulārie mehānismi kolorektālā vēža gadījumā joprojām nav izpētīti.Tāpēc mēs izvēlējāmies šo lncRNS turpmākai izpētei.
Lai pētītu DARS-AS1 ekspresiju pacientiem, mēs visaptveroši analizējām 10 327 audzēju paraugus no Cancer Genome Atlas (TCGA) projekta.Mūsu rezultāti liecina, ka DARS-AS1 ir plaši izteikts un ievērojami pārregulēts veselās šūnās dažādos audzējos, tostarp resnās zarnas adenokarcinomā (COAD), nieru tīro šūnu karcinomā (KIRC) un nieru papilāru šūnu karcinomā (KIRP)..Ļoti maz (1.d attēls un papildu attēls 1a, b). Pārī savienotu veselīgu / audzēja paraugu analīze vēl vairāk apstiprināja ievērojami augstāku DARS-AS1 ekspresiju urīnpūšļa urotēlija karcinomas (BLCA), nieru nieru tīro šūnu karcinomas (KIRC), prostatas adenokarcinomas (PRAD), plaušu plakanšūnu karcinomas (LUSC) audzējos. , dzemdes korpusa endometrija karcinoma (UCEC), plaušu adenokarcinoma (LUAD), aknu hepatocelulārā karcinoma (LIHC), nieru nieru papilāru šūnu karcinoma (KIRP) un resnās zarnas adenokarcinoma (COAD) (p vērtība < 0,05) (1.e–m att.) . Pārī savienotu veselīgu / audzēja paraugu analīze vēl vairāk apstiprināja ievērojami augstāku DARS-AS1 ekspresiju urīnpūšļa urotēlija karcinomas (BLCA), nieru nieru tīro šūnu karcinomas (KIRC), prostatas adenokarcinomas (PRAD), plaušu plakanšūnu karcinomas (LUSC) audzējos. , dzemdes korpusa endometrija karcinoma (UCEC), plaušu adenokarcinoma (LUAD), aknu hepatocelulārā karcinoma (LIHC), nieru nieru papilāru šūnu karcinoma (KIRP) un resnās zarnas adenokarcinoma (COAD) (p vērtība < 0,05) (1.e–m att.) .Pārī savienotu veselīgu / audzēju paraugu analīze apstiprināja arī ievērojami augstāku DARS-AS1 ekspresiju urīnpūšļa urotēlija karcinomas (BLCA), skaidru šūnu nieru un nieru šūnu karcinomas (KIRC), prostatas adenokarcinomas (PRAD), plaušu plakanšūnu karcinomas (LUSC) audzējos., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , dzemdes ķermeņa endometrija karcinoma (UCEC), plaušu adenokarcinoma (LUAD), aknu hepatocelulārā karcinoma (LIHC), nieru papilāru šūnu karcinoma (KIRP) un resnās zarnas adenokarcinoma (COAD) (p vērtība < 0,05) (1.e– m att.) .配对 健康/肿瘤样本 分析 分析 进一步 证实 了 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (KIRC) 、 前列 腺腺癌 (PRAD) 、 肺鳞状 细胞癌 (Lusc) 肿瘤 中 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的显着 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， 肝肝 细胞癌 （LIHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） 和结肠腺癌 （COAD） （P 值<0,05 (图1e-m）).配 健康 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 DARS-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (PRAD) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（Ucel） 肺腺癌 （LUAD） 肝肝 细胞癌 （（LiHC） 肾 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Veselīgu / audzēju pāru paraugu analīze vēl vairāk apstiprināja DARS-AS1 lomu urīnpūšļa urotēlija karcinomas (BLCA), skaidru šūnu nieru šūnu karcinomas (KIRC), prostatas adenokarcinomas (PRAD) un plaušu plakanšūnu karcinomas (LUSC) audzējos.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresija korpusa dzemdes karcinomas (UCEC), plaušu adenokarcinomas (LUAD), hepatocelulārā karcinomas (LIHC), nieru papilāru šūnu karcinomas (KIRP) un resnās zarnas adenokarcinomas (COAD) gadījumā (p vērtība <0,05) (1.e -m attēls).Kopumā šie rezultāti liecina, ka DARS-AS1 ir plaši un ļoti izteikts dažādos vēža veidos.
Tā kā DARS-AS1 un DARS (gēnam, kas kodē antisense virkni) ir viens un tas pats promotors un tie atrodas viens otram blakus, mēs izstrādājām shRNS, lai īpaši iznīcinātu DARS-AS1, bet ne DARS (papildu 2.a, b un 2. papildu tabula). .Papildus SW620 mēs izmantojām arī trīs citas šūnu līnijas, kas ļoti ekspresē DARS-AS1, lai izpētītu shRNS notriekšanas efektivitāti un funkciju (3. papildu tabula).Mūsu rezultāti liecināja, ka visas trīs izstrādātās shRNS sasniedza vismaz 80% DARS-AS1 notriekšanas efektivitāti, maz ietekmējot DARS mRNS daudzumu (papildu 2.c–f attēls).Turklāt mēs noskaidrojām, ka DARS-AS1 notriekšana ar šīm shRNS ievērojami kavēja šūnu augšanu kolorektālā vēža šūnu līnijās SW620 (49,7%) un HCT116 (27,7%), krūts vēža šūnu līnijā MBA-MD-231 (53,4%).) un HepG2 hepatomas šūnu līniju (samazinājums par 92,7%), kā arī to spēju veidot nenoenkurotas sfēras (vidēji samazinājums ~50,8%, 44,6%, 40,7% un 75,7% uz vienu šūnu līniju) (2.a, b att.).SW620 koloniju veidošanās testa rezultāti vēl vairāk apstiprināja, ka DARS-AS1 shRNS būtiski inhibēja šūnu proliferāciju ar vidējo samazinājumu par aptuveni 69,6% (2.c attēls).
Kontroles shRNS un DARS-AS1 shRNS ietekme uz šūnu proliferāciju (a) un sferoīdu veidošanos (b) SW620, HCT116, MBA-MD-231 un HepG2 šūnās.c Kontroles shRNS un DARS-AS1 shRNS ietekme uz koloniju veidošanos SW620 šūnās.SW620 šūnu, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1, šūnu proliferācija (d), sferoīdu veidošanās (e) un koloniju veidošanās (f).Parādītie dati ir trīs eksperimentu vidējā ± standarta novirze.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 un *** p ≤ 0,001 ar divpusējo Stjudenta t testu.
Lai papildinātu funkciju zuduma pētījumus, mēs pēc tam izveidojām SW620 šūnas, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1 (papildu attēls 2g).DARS-AS1 pārmērīga ekspresija ievērojami palielināja šūnu augšanu (1,8 reizes), nenoenkurotu sferoīdu veidošanos (1,4 reizes) un koloniju veidošanos (3,3 reizes) SW620 šūnās (2.d–f att.).Mēs apstiprinājām šo rezultātu, izmantojot citu DARS-AS1 ekspresējošu šūnu līniju A549.Šī pastiprinātā šūnu proliferācija DARS-AS1 pārmērīgas ekspresijas dēļ tika novērota arī A549 šūnās (papildu attēls 2h, i un 3. papildu tabula).Kopumā šie ieguvumu un zaudējumu pētījumi parāda, ka DARS-AS1 veicina vēža šūnu proliferāciju in vitro .
Lai izpētītu pamatā esošo mehānismu, ar kuru DARS-AS1 regulē šūnu proliferāciju, mēs veicām RNS nolaižamo analīzi, lai identificētu tā iespējamos proteīnu saistošos partnerus.RT-qPCR rezultāti parādīja, ka aptuveni 86, 2% DARS-AS1 atrodas SW620 šūnu citoplazmā (papildu attēls 3a).Pēc tam in vitro transkribēto biotinilēto DARS-AS1 vai pseidoRNS inkubēja ar SW620 šūnu lizātiem, kam sekoja SDS-PAGE atdalīšana.Sekojošā sudraba krāsošana parādīja, ka atšķirīga josla (~38 kDa) bija ievērojami bagātināta DARS-AS1 vilkšanas paraugos, bet ne fiktīvajos RNS vai lodīšu paraugos (3.a attēls).Šī josla tika identificēta kā PKR aktivējošs proteīns (PACT) ar masas spektrometriju (MS) un tālāk tika apstiprināts ar imūnblotēšanu SW620, HCT116 un HepG2 šūnu līnijās (3.a, b attēls).DARS un saistīto PACT proteīnu – PKR un TRBP – bagātināšana tika pētīta arī, izmantojot RNS analīzi ar Western blotēšanu (WB).Rezultāti liecināja, ka netika atrasta tieša mijiedarbība starp DARS-AS1 RNS un šiem trim proteīniem (papildu 3.b attēls).Specifisko mijiedarbību starp DARS-AS1 un PACT vēl vairāk apstiprināja RNS imūnprecipitācijas (RIP) analīze, kas parādīja, ka DARS-AS1 bija ievērojami bagātināts ar anti-PACT antivielām, bet ne ar citām kontroles RNS (3.c attēls).Lai noteiktu, vai DARS-AS1 tieši mijiedarbojas ar PACT, ja nav citu šūnu komponentu, tika veikts in vitro bioslāņa interferometrijas (BLI) tests, izmantojot attīrītu PACT.Ar biotīnu iezīmētā DARS-AS1 vai fiktīva RNS tika imobilizēta uz streptavidīna (SA) biosensoriem un pēc tam inkubēta kinētiskā buferšķīdumā, kas satur 1 μM PACT.Proti, PACT stipri saistījās ar DARS-AS1 (KD vērtība ~ 26, 9 nM), bet ne, lai atdarinātu RNS (3.d attēls).Kopumā šie rezultāti parāda tiešu mijiedarbību un augstu afinitāti starp DARS-AS1 un PACT.
RNS vilkšanas analīze identificēja DARS-AS1, kas mijiedarbojas ar PACT SW620 šūnās.Iepriekš saistīto proteīnu sudraba krāsošana.Apakšējie imūnbloti tika veikti ar anti-PACT antivielu.b RNS nolaižamā analīze tika veikta HCT116 (augšējā) un HepG2 (apakšējā) šūnās.PACT bagātināšana tika noteikta ar imūnblotēšanu.cRNS imūnprecipitācijas (RIP) testi tika veikti SW620 šūnās, izmantojot norādītās antivielas.d PACT saistīšanās līknes ar pilna garuma DARS-AS1 vai kontroles RNS tika iegūtas, izmantojot bioslāņa interferometriju (BLI).RNS tika imobilizēta uz streptavidīna biosensora.Asociācijas mērīšanai tika izmantots 1 μM PACT.e RNS vilkšanas tests tika veikts, izmantojot biotinilētu pilna garuma DARS-AS1 vai saīsinātu (augšpusē).Imūnblots, kas parāda saņemto PACT (apakšā).f Attīrīts atzīmētais PACT tika inkubēts ar biotinilētu pilna garuma DARS-AS1 vai saīsināts (kā e) in vitro RIP testam.Ekstrahētā RNS tika pārbaudīta ar RT-qPCR.g Dažādu RNS fragmentu relatīvā afinitāte pret PACT tika iegūta, izmantojot bioslāņa interferometriju.Analīzei tika izmantots 100 nM RNS un 1 μM RAST.h In vitro RIP testi tika veikti, izmantojot attīrītu neskartu vai saīsinātu marķētu PACT.Ekstrahētā RNS tika pārbaudīta ar RT-qPCR.i SW620 šūnu augšanas ātrums, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1, PACT vai abus.j Pilna garuma vai saīsināta DARS-AS1 pārmērīgai ekspresijai SW620 šūnās bija atšķirīga ietekme uz šūnu augšanu.k Apoptoze tika noteikta ar imūnblotēšanu ar anti-PARP antivielu.l DARS-AS1 izslēgšana izraisa SW620 šūnu apoptozi, kā parādīts plūsmas citometrijā.Parādītie dati ir trīs eksperimentu vidējā ± standarta novirze. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, izmantojot divpusējo Stjudenta t testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, izmantojot divpusējo Stjudenta t testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, izmantojot divpusējo Stjudenta t-testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, izmantojot divpusējo Stjudenta t-testu.
Pēc tam mēs izveidojām trīs biotinilētus DARS-AS1 RNS fragmentus, izmantojot in vitro transkripciju, lai identificētu PACT asociācijai nepieciešamo DARS-AS1 reģionu (3.e attēls).RNS analīzes rezultāti parādīja, ka katrs fragments varēja mijiedarboties ar PACT, bet 3'-gala apgabalā (384–768 nukleotīdi, kas apzīmēti ar A3) bija vairāk nekā 1–384 nukleotīdi, kas apzīmēti ar A1) (3.e attēls).Līdzīgi rezultāti tika novēroti in vitro RIP testā, izmantojot rekombinanto PACT (3.f attēls).Saskaņā ar šiem rezultātiem eksperimenti, lai saistītu imobilizētos RNS fragmentus ar PACT, izmantojot BLI, arī parādīja, ka PACT ir lielāka afinitāte pret A3 (384–768 nt) (KD vērtība aptuveni 94, 6 nM), bet gandrīz nekādas saites ar citām jomām.(3.d attēls).
Mēs arī pārbaudījām saistītos saistošos reģionus PACT.PACT satur trīs funkcionālos domēnus, no kuriem divi ir konservēti divpavedienu RNS saistošie domēni (dsRBD) un trešais domēns (apzīmēts ar D3), kas darbojas kā proteīnu mijiedarbības aktivators.Lai pārbaudītu katra domēna lncRNS saistīšanās spēju, mēs izveidojām trīs mutācijas, kas noņēma katru no trim domēniem, un veica in vitro RIP testu.Mūsu rezultāti parādīja, ka PACT trešā domēna (D3) dzēšana ievērojami samazināja tā mijiedarbību ar DARS-AS1 (par 0,11 reizēm, salīdzinot ar neskartu PACT), salīdzinot ar pārējām divām mutācijām (3.h att.), tika parādīts, ka atbrīvošanās. no D3 mijiedarbojās ar DARS.-AC1.Kopumā šie rezultāti liecina, ka mijiedarbība starp DARS-AS1 un PACT var notikt galvenokārt caur DARS-AS1 3′ galu un PACT D3 domēnu.
Mēs atzīmējām, ka DARS-AS1 neietekmēja PACT ekspresiju un PACT neietekmēja DARS-AS1 (papildu attēls 3c).Pēc tam mēs pārbaudījām PACT notriekšanas ietekmi uz šūnu augšanu.Atšķirībā no DARS-AS1, relatīvās šūnas pieauga 1, 5–3 reizes ātrāk, kad PACT tika notriekts (papildu attēls 3d).Koloniju veidošanās testa rezultāti liecināja, ka pēc shRNS apstrādes ar PACT šūnas veidoja 2–3 reizes lielākas kolonijas (papildu attēls 3e).Lai pārbaudītu, vai DARS-AS1 regulē šūnu proliferāciju, izmantojot PACT, mēs izveidojām SW620 šūnas, kas pārmērīgi ekspresē PACT, DARS-AS1 vai abus.Pārmērīga PACT ekspresija uzrādīja būtisku šūnu proliferācijas kavēšanu (3.i attēls).Lai gan DARS-AS1 pārmērīga ekspresija pati par sevi ievērojami veicināja šūnu proliferāciju, nebija būtiskas atšķirības to šūnu augšanas ātrumā, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1 un PACT.Šie rezultāti liecina, ka PACT var neitralizēt palielināto proliferāciju, ko izraisa DARS-AS1 pārmērīga ekspresija.
Tā kā dažādiem DARS-AS1 reģioniem ir atšķirīgas PACT saistīšanās spējas, mēs pētījām to relatīvo ietekmi uz šūnu proliferāciju ar dažādu DARS-AS1 fragmentu pārmērīgu ekspresiju.Salīdzinot ar pārējiem diviem fragmentiem, DARS-AS1 bija pārmērīgi ekspresēts 3' galā (384–768 nt), kas ir galvenais ar PACT saistītais reģions DARS-AS1, kuram bija visaugstākā spēja stimulēt šūnu proliferāciju (3.j att.).Šie rezultāti liecina par pozitīvu korelāciju starp DARS-AS1 saistīšanās spēju un bioloģisko funkciju.
Ir ziņots, ka PACT ir pro-apoptotisks proteīns19.Tāpēc mēs pētījām DARS-AS1 ietekmi uz apoptozi.Kā gaidīts, DARS-AS1 notriekšana ievērojami palielināja PARP šķelšanos SW620 šūnās un palielināja aneksīna V pozitīvo šūnu īpatsvaru SW620, HCT116, HepG2 un MBA-MD-231 šūnu līnijās (3.k attēls).3).3f – h), norādot, ka DARS-AS1 anti-apoptotiskā iedarbība vēža šūnās ir pretēja PACT apoptozi izraisošajai funkcijai.Kopumā šie rezultāti liecina, ka DARS-AS1 onkogēnās funkcijas mehānisms var būt PACT funkcijas kavēšana.
Tālāk mēs izpētījām asociācijas DARS-AS1-PACT funkcionālās sekas.Ir ziņots, ka PACT aktivizē PKR, izmantojot tiešu mijiedarbību, kas pēc tam uzlabo eIF2α fosforilāciju, izraisot translācijas dzēšanu un apoptozi17.Pirmkārt, mēs pārbaudījām, vai DARS-AS1 ietekmē PACT un PKR šūnu lokalizāciju.Konfokālās fluorescences mikroskopija parādīja, ka PACT un PKR bija ļoti kolokalizēti SW620 šūnās ar vidējo Pīrsona korelācijas koeficientu 0, 72.Tikmēr DARS-AS1 pārmērīga ekspresija ievērojami samazināja PACT un PKR līdzlokalizāciju (vidējais Pīrsona korelācijas koeficients 0, 61) (4.a attēls).Lai noskaidrotu, vai DARS-AS1 varētu modulēt PACT-PKR mijiedarbību, mēs veicām līdzimunoprecipitācijas (co-IP) testu ar anti-PACT antivielu SW620 šūnu lizātos.PKR bija ļoti bagātināts ar anti-PACT kontroles šūnās, savukārt PKR atgūšanās bija ievērojami samazināta lizātos no šūnām, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1 (4.b attēls).In vitro proteīnu saistīšanās testos tika izmantoti attīrīti marķēti PACT un PKR.Attiecīgi tie, kas nodrošināja DARS-AS1, bet bez kontroles RNS, uzrādīja nomāktu PACT-PKR mijiedarbību (4.c attēls).Visi rezultāti parādīja, ka DARS-AS1 pārtrauca PACT un PKR saziņu.
Izmantojot konfokālās fluorescences mikroskopiju, tika novērota PACT un PKR līdzās lokalizācija kontroles šūnās vai šūnās, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1.Kodoli tika iekrāsoti ar DAPI.Statistiskie rezultāti iegūti no 16 fotogrāfijām.b Kopimunoprecipitācija (ko-IP), izmantojot anti-PACT antivielu kontroles SW620 šūnu lizātos vai šūnās, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1.c Marķētais PACT, attīrīts PKR un in vitro transkribēts ar DARS-AS1 vai imitācijas RNS tika inkubēts in vitro olbaltumvielu saistīšanās analīzei.Imunoprecipitācijai tika izmantotas anti-karoga antivielas.d Imunobloti ar norādītajām antivielām tika veikti SW620 un HCT116 šūnās, kas tika transficētas ar kontroles shRNS vai DARS-AS1-shRNS, kam sekoja seruma badošanās.DARS-AS1 ekspresijas līmeņi mainīja šūnu jutību pret tapsigargīnu.SW620 šūnas tika transficētas ar DARS-AS1 shRNS, DARS-AS1 pārmērīgas ekspresijas plazmīdu vai kontroles plazmīdu.Šūnas tika apstrādātas ar tapsigargīnu 48 stundas, un šūnu dzīvotspēja tika noteikta, izmantojot MTS reaģentu.f In vitro aktivācijas testam un imūnblotu noteikšanai tika izmantota in vitro transkribēta DARS-AS1 vai fiktīva RNS un attīrīts PACT.g Imunobloti, izmantojot šīs antivielas, tika veikti ar SW620-ctrl šūnām (pa kreisi) vai šūnām, kas pārmērīgi ekspresē PKR mutantus (pa labi).Pēc tam šīs šūnas tika transficētas ar kontroles shRNS vai DARS-AS1-shRNS, kam sekoja seruma badošanās.h Plūsmas citometrija parādīja, ka mutanta PKR inaktivācija kompensēja DARS-AS1 izraisīto apoptozi SW620 šūnās.i Imunobloti ar norādītajām antivielām tika veikti SW620 (pa kreisi) vai HCT116 (pa labi) šūnās.Šūnas, kas transficētas ar kontroles shRNS vai DARS-AS1 shRNS, ir bez seruma un tiek papildinātas ar 100 nM PKR C16 inhibitoru vai DMSO.Mēroga josla = 5 µm.Parādītie dati ir trīs eksperimentu vidējā ± standarta novirze.* p ≤ 0,05 divvirzienu Stjudenta t-tests.
Parasti tiek uzskatīts, ka, tiklīdz PACT mijiedarbojas ar PKR17, var izraisīt PKR fosforilāciju pie Thr451.Mūsu rezultāti liecināja, ka PKR fosforilācijas līmenis bija ievērojami paaugstināts DARS-AS1 notriektajās šūnās pēc seruma badošanās (4.d attēls un papildu attēls 4a).Attiecīgi mēs noskaidrojām, ka DARS-AS1 shRNS ievērojami palielināja arī eIF2α, galvenā PKR substrāta, fosforilāciju (4.d attēls un papildu 4.a attēls).Thapsigargin ir ER stresa faktors, kas izraisa ER izdalīšanos Ca2+.Ir ziņots, ka ārstēšana ar tapsigargīnu izraisa PACT ekspresiju un aktivāciju, kas tālāk mijiedarbojas ar un aktivizē PKR, izraisot apoptozi, palielinot eIF2α fosforilāciju18,61.Šeit mēs izmantojām thapsigargin kā PACT / PKR ceļa stimulatoru, lai izpētītu, vai DARS-AS1 var palīdzēt šūnām pārvarēt stresu, inhibējot PACT / PKR ceļu.Mēs novērojām, ka DARS-AS1 ekspresijas līmenis pozitīvi korelē ar šūnu rezistenci pret tapsigargīnu.SW620 šūnas, kas pārmērīgi ekspresē DARS-AS1, izdzīvoja labāk, ja tās tika apstrādātas ar tapsigargīnu, savukārt šūnas ar DARS-AS1 notriekšanu kļuva jutīgākas (4.e attēls).Saskaņā ar šiem rezultātiem DARS-AS1 pārmērīga ekspresija samazināja tapsigargīna izraisīto PKR fosforilāciju (papildu 4.b attēls).Turpretim pēc apstrādes ar tapsigargīnu PKR un eIF2α tika fosforilēti lielākā mērā DARS-AS1 notriektajās šūnās, salīdzinot ar kontroles šūnām (papildu 4.b attēls).Interesanti, ka tapsigargīns izraisīja DARS-AS1 ekspresiju no devas atkarīgā veidā, kas var liecināt par DARS-AS1 pretstresa funkciju (papildu attēls 4c).Turklāt, lai apstiprinātu šos novērojumus, mēs veicām in vitro aktivizācijas testus.Īsumā, PKR tika attīrīts no šūnu lizātiem, izmantojot anti-PKR antivielu, pēc tam inkubēts ar rekombinanto PACT un DARS-AS1, kas transkribēts in vitro.Pēc fermentatīvās reakcijas fosfo-PKR tika noteikts, izmantojot WB.Mūsu rezultāti liecināja, ka PKR fosforilāciju ievērojami kavēja DARS-AS1, bet ne kontroles RNS (4.f attēls).Šie in vitro un in vivo rezultāti liecina, ka DARS-AS1 inhibē PACT mediētu PKR aktivāciju.Tajā pašā laikā mēs novērojām arī PACT atkopšanas samazināšanos DARS-AS1 klātbūtnē (4.f attēls).Šis rezultāts atbilst in vitro proteīnu saistīšanās testa rezultātiem (4.c attēls) un atkal ilustrē DARS-AS1 bloķējošo funkciju PACT-PKR asociācijai.
Ser246 un Ser287 PACT D3 domēnā ir nepieciešami PKR aktivācijai šūnu stresa apstākļos.Divu serīna atlikumu aizstāšana ar alanīnu radīja mutantu PACT (mutD), kas aktivizēja PKR bez stresa, un alanīna (mutA) aizstāšana apvērsa protokolu.Tā kā mēs esam pierādījuši šī domēna nozīmi tiešā saistībā ar DARS-AS1, mēs izveidojām šos divus PACT mutantus, lai pārbaudītu, vai šie atlikumi varētu būt iesaistīti arī mijiedarbībā ar DARS-AS1.Interesanti, ka abi mutanti zaudēja spēju saistīties ar DARS-AS1 (papildu attēls 4d), kas liecina, ka efektīvai mijiedarbībai ar DARS-AS1 var būt nepieciešama pilnīga PACT proteīna struktūra.
Turklāt mūsu rezultāti arī liecina, ka DARS-AS1-shRNS izraisīto šūnu proliferācijas inhibīciju var daļēji atjaunot, pārmērīgi ekspresējot dominējošo negatīvo PACT mutantu (PACTmutA) vai dominējošo negatīvo PKR mutantu (PKRmut) (papildu attēls 4e. e).Dominējoši negatīvo PKR mutantu pārmērīga ekspresija samazināja PKR fosforilāciju, ko izraisīja DARS-AS1 notriekšana, kā arī eIF2α fosforilāciju šūnās, kurām nebija seruma (4.g attēls).Vēl svarīgāk ir tas, ka DARS-AS1 notriekšanas izraisīto apoptotisko šūnu īpatsvars tika samazināts arī šūnās, kas pārmērīgi ekspresē PKRmut (4.h attēls un papildu attēls 4g).PKR kināzes aktivitātes kavēšana arī pasliktina DARS-AS1 funkciju, jo rezultāti parādīja, ka DARS-AS1 notriekšana reti izraisīja PKR un eIF2α fosforilēšanos, kad šūnas tika apstrādātas ar PKR specifisku C16 inhibitoru (4.i attēls un papildu attēls 4h).).Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka DARS-AS1 vismaz daļēji veicina šūnu proliferāciju, inhibējot PACT mediētu PKR aktivāciju.
Lai turpinātu izpētīt DARS-AS1 lomu audzēja veidošanās procesā, mēs veicām in vivo eksperimentus, izmantojot peles ksenotransplantāta modeli. Rezultāti liecina, ka DARS-AS1 iznīcināšana ievērojami samazināja audzēja augšanu pelēm (p vērtība < 0,0001) (5.a attēls). Rezultāti liecina, ka DARS-AS1 iznīcināšana ievērojami samazināja audzēja augšanu pelēm (p vērtība < 0,0001) (5.a attēls). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Rezultāti liecina, ka DARS-AS1 notriekšana krasi samazina audzēja augšanu pelēm (p vērtība < 0,0001) (5.a attēls).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a（结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис.). Rezultāti parādīja, ka DARS-AS1 notriekšana ievērojami samazināja audzēja augšanu pelēm (p vērtība < 0,0001) (5.a attēls).Tādējādi DARS-AS1 notriekšanas grupā tika ievērojami samazināts vidējais audzēja tilpums par aptuveni 72, 9% un vidējā audzēja masa par aptuveni 87, 8% (5.b-d attēls).Šie rezultāti liecina, ka DARS-AS1 var ievērojami veicināt audzēja augšanu in vivo .
Reklāmas DARS-AS1 notriekšanas ietekme uz kolorektālo onkoģenēzi plikām pelēm.Tiek parādītas augšanas līknes (a), audzēja lielums (b), svars (c) un audzēja attēli (d).Kļūdu joslas apzīmē ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, izmantojot divpusējo Stjudenta t testu. n = 10. ****p < 0,0001, izmantojot divpusējo Stjudenta t testu. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 divpusējs Stjudenta t-tests.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 divpusējs Stjudenta t-tests.e Kaplan-Meier analizēja korelāciju starp DARS-AS1 ekspresijas līmeņiem un kopējo dzīvildzi pacientiem ar UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM un LGG.Augsts DARS-AS1 ekspresijas līmenis pacientiem bija top 50%;zemais DARS-AS1 ekspresijas līmenis pacientiem bija apakšējos 50%.p vērtības tika noteiktas, izmantojot log ranga testu.f Piedāvātais modelis, kurā DARS-AS1 regulē PACT-PKR ceļu un audzēja augšanu.
Lai labāk izprastu DARS-AS1 klīnisko ietekmi, mēs pārbaudījām korelāciju starp tās izpausmi un pacienta izdzīvošanu.Analizējot TCGA datu kopu, mēs atklājām, ka augstāka DARS-AS1 ekspresija bija saistīta ar uveālo melanomu (UVM), nieru hromofobiju (KICH), nieru papilāru šūnu karcinomu (KIRP), mezoteliomu (MESO), multipleksu.Zemāka dzīvildze bija nozīmīgi saistīta ar glioblastomas morfozi (GBM) un pacientiem ar zemas pakāpes smadzeņu gliomu (LGG) (5.e attēls).Šie rezultāti liecina, ka DARS-AS1 var būt nozīmīga loma klīniskā audzēja progresēšanā un var būt potenciāls prognozējošs biomarķieris vairāku vēža veidu gadījumā.
Šajā pētījumā, izmantojot liela mēroga CRISPRi funkcionālo skrīningu, mēs noteicām, ka DARS-AS1 lncRNS pārvar vēža šūnu stresu, regulējot divus galvenos stresa reaģētājus, PACT un PKR.Mijiedarbojoties tieši ar PACT, DARS-AS1 inhibēja PACT mediētu PKR aktivāciju, tādējādi novēršot apoptotisku šūnu nāvi un veicinot šūnu proliferāciju (5.f attēls).DARS-AS1 regulēšana ir novērota vairāku veidu vēža gadījumā, kas liecina, ka tā funkcija, kas veicina vēža šūnu izdzīvošanu stresa apstākļos, var būt plaši piemērojama vairākiem vēža veidiem.
PACT ir identificēts kā PKR aktivatora proteīns, un PACT mediētai PKR aktivācijai ir svarīga loma stresa reakcijās, regulējot transkripciju, translāciju, apoptozi un citus svarīgus šūnu procesus62.Gadu desmitiem ir mēģināts izprast PACT-PKR kaskādes vēža specifisko regulējumu.Šeit mūsu pētījums atklāja atšķirīgu PACT-PKR regulēšanas mehānismu vēža šūnās, izmantojot šūnu lncRNS DARS-AS1, kas tieši saistās ar PACT, bloķē PACT-PKR mijiedarbību, inhibē PKR aktivāciju un eIF2α fosforilāciju, tādējādi kavējot stresa izraisītu apoptozi un stimulējot iespējamo vēža izplatīšanos.šūnas.Šis atklājums atklāj iespējamos lncRNS mērķus vēža prognozēšanai un terapijai.
Mūsu dati parādīja, ka DARS-AS1 knockdown sensibilizē šūnas pret seruma badu, ievērojami palielinot fosforilēto PKR un eIF2α.Šie rezultāti liecina, ka DARS-AS1 veicina vēža šūnu izdzīvošanu skarbos apstākļos, inhibējot PACT / PKR aktivitāti.Vairākas citas nekodējošas RNS, piemēram, ASPACT un nc886, arī ir iesaistītas PACT / PKR asī, samazinot PACT48 mRNS vai regulējot autofosforilāciju, saistoties ar PKR49, 50, 64.Tostarp DARS-AS1 darbojas kā PACT-PKR asociācijas traucētājs.Šis pētījums bagātina mūsu izpratni par PACT / PKR ass regulēšanu un lncRNS lomu stresa reakcijās.
PACT satur trīs atsevišķus domēnus.Katrs no pirmajiem diviem dsRBD ir pietiekams, lai panāktu augstu PACT saistīšanos ar PKR, savukārt trešais domēns (D3) ir nepieciešams PKR aktivācijai in vitro un in vivo.Mūsu pētījums parādīja, ka DARS-AS1 galvenokārt mijiedarbojas ar D3 domēnu (3.h att.).Ņemot vērā lncRNS lielo izmēru (768 nukleotīdi), DARS-AS1 saistīšanās ar D3 var fiziski kavēt mijiedarbību starp dsRBD un PKR PACT domēnu, tādējādi bloķējot PACT un PKR saistību.PACT punktu mutācijas, kas aizstāja Ser246 un Ser287 D3 ar alanīnu vai aspartātu, izjauca tā saistīšanās afinitāti pret DARS-AS1, norādot uz D3 vispārējo strukturālo un elektrisko īpašību nozīmi to saistībā.Nākotnē būs nepieciešama sīkāka informācija par šo mehānismu, izmantojot precīzāku bioķīmisko analīzi un augstas izšķirtspējas PACT strukturālo analīzi.
Iepriekšējie pētījumi ir ziņojuši, ka DARS-AS1 veicina šūnu proliferāciju, izmantojot vairākus mehānismus51,52,53.Vienā piemērā pētnieki novēroja, ka DARS-AS1 pārregulēja savu antisense proteīnu kodējošo DARS gēnu, mērķējot uz miP-194-5p nieru vēža šūnās.Tomēr šajā pētījumā DARS-AS1 notriekšanai bija neliela ietekme uz DARS transkripciju vairāku veidu vēža gadījumā, tostarp vismaz kolorektālā, krūts un aknu vēža gadījumā.Tā kā lncRNS piemīt šūnām un audiem specifiski ekspresijas modeļi, funkcionālie mehānismi var nebūt saglabāti dažādos vēža veidos, kas var veicināt šo neatbilstību starp mūsu novērojumiem un iepriekšējiem dažādu vēža veidu novērtējumiem.Ir nepieciešami īpaši pētījumi, lai noskaidrotu dažādu fizioloģisko un patoloģisko procesu specifiskos mehānismus.
Klīnisko datu analīze parādīja, ka DARS-AS1 ekspresija audzējos ir apgriezti korelē ar vēža pacientu izdzīvošanu, kas uzsver DARS-AS1 / PACT / PKR ass nozīmi vēža prognozē.Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījums parāda, ka DARS-AS1 ir PACT / PKR signalizācijas ass regulators, veicina vēža šūnu proliferāciju un kavē apoptozi stresa reakcijas laikā, kas nodrošina vēl vienu pētījumu virzienu un interesē turpmākos iespējamos ārstēšanas pētījumus. .
Cilvēka šūnu līnijas SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 un HEK293T tika iegūtas no Nacionālās šūnu līnijas resursu infrastruktūras Ķīnā.Visas šūnas tika uzturētas DMEM barotnē (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), kas papildināta ar 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) un 1% penicilīna-streptomicīnu (Thermo Fisher Scientific) 37 ° C temperatūrā, 5% CO2.inkubators.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfors S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfors S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulīns, CST (2128);parastā peles IgG, CST (5415S);normāls truša IgG, CST (2729S).Antivielas tika atšķaidītas 1:1000 PBST Western blotēšanai un 1:100 IP.
sgRNS tika izstrādātas, izmantojot publiski pieejamu rīku CRISPR-ERA66.Mēs izmantojām noklusējuma rīka parametrus sgRNS izstrādei un algoritmu aprēķināja sgRNS saistīšanās vietas 3 kb reģionā.centrēts uz TSS.SgRNS oligonukleotīdu kopas tika sintezētas uzņēmumā CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) un klonētas humanizētās pgRNS plazmīdās (Addgene #44248).Kopā 12 µg apvienotās humanizētās pgRNS plazmīdas, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) un 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) tika kotransfekēti 5 x 106 HEK293T trauciņos DNS Transfect 10 Transfe. šūnas (CWBIO, Pekina, Ķīna), ievērojot ražotāja norādījumus.Vīrusu saturošie supernatanti tika savākti 48 un 72 stundas pēc transfekcijas un filtrēti caur 0, 45 µm filtru.Skrīningam SW620 šūnas, kas ekspresē dCas9 / KRAB saplūšanas proteīnu, tika iegūtas ar vīrusu transdukciju.Modificētās SW620 šūnas tika inficētas ar vīrusu bibliotēku četros neatkarīgos infekcijas eksperimentos ar MOI 0, 1–0, 3, un 2 dienas tika ņemti paraugi ar 2 μg / ml puromicīnu (Sigma, Sentluisa, MO).Pēc tam šūnas tika kultivētas 18 dienas in vitro ar minimālo bibliotēkas pārklājumu 500 šūnas / sgRNS skrīningam.
Genomiskā DNS tika ekstrahēta saskaņā ar QIAamp DNS Blood Midi komplekta (QIAGEN, Diseldorfa, Vācija; 51183) norādījumiem.Kopumā bibliotēkas izveidošanai tika izmantoti 100 μg genoma DNS vienā bioloģiskajā atkārtojumā.SgRNS reģions tika pastiprināts ar divām PCR kārtām un saistīts ar svītrkodu.
PCR produkti tika attīrīti, izmantojot NucleoSpin® gelu un PCR attīrīšanas komplektu (MACHEREY-NAGEL, Düren, Vācija; 740609.250), un kvantitatīvi noteikti, izmantojot Qubit™ HS divpavedienu DNS noteikšanas komplektu (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Šūnu proliferācijas mērīšanai tika izmantots MTS tests.Šūnas tika iesētas 96 bedrīšu plāksnēs ar sākotnējo blīvumu 2000 šūnas/iedobē.Relatīvais šūnu skaits tika mērīts katru dienu norādītajā laikā kopā 4-6 dienas.Katrai iedobei 20 μl MTS reaģenta (Promega) atšķaida ar 100 μl DMEM, inkubēja ar šūnām 4 stundas 37 ° C temperatūrā, un pēc tam tika mērīts OD490.
Nenoenkurotas izaugsmes spēja tika atklāta, analizējot sfēru veidošanos.Īsumā, 2000 šūnas, kas transficētas ar shRNS DARS-AS1 vai kontroles shRNS, tika kultivētas īpaši zemas piestiprināšanas mikroplatēs (Corning), mainot barotni ik pēc 4 dienām.Sferoīdi tika skaitīti pēc 14 dienām.Uzlabošanas testam tika izmantotas 500 šūnas, kas transficētas ar DARS-AS1 pārmērīgas ekspresijas plazmīdu vai kontroles plazmīdu, pretējā gadījumā metode nemainījās.
RNS tika transkribēta, izmantojot T7 RNS polimerāzi un biotīna-16-UTP (Roche 1138908910) saskaņā ar Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) norādījumiem.Šeit izmantotie grunti ir uzskaitīti 4. papildu tabulā.
Proteīnus kodējošie PACT vai PKR reģioni tika klonēti pET15b (Addgene #73619) un pārveidoti par BL21 (DE3).Baktērijas inkubēja nakti LB, kas tika piegādāts ar ampicilīnu, un pēc tam atšķaida 100 reizes ar svaigu LB.Kad barotnes OD600 sasniedza 0, 8, proteīna ekspresijas ierosināšanai tika pievienots 1 mM IPTG.Pēc inkubācijas nakti ar maigu kratīšanu (250 apgr./min 20 ° C) šūnu granulas tika savāktas, centrifugējot (4000 apgr./min, 10 minūtes, 4 ° C).Atkārtoti suspendējiet šūnu granulu līzes buferšķīdumā (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) un inkubējiet uz ledus 30 minūtes, pēc tam apstrādājiet ar ultraskaņu (15 min, 5 s ieslēgts/izslēgts, uz ledus) un centrifugējiet (13 000). apgr./min)., 30 min, 4°С).Pēc tam supernatants tika ielādēts uz Ni-NTA sveķiem (QIAGEN) 3 reizes 4 ° C temperatūrā, 4 reizes mazgāts ar mazgāšanas buferšķīdumu (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazola, 250 mM NaCl) un eluēja 3 reizes, ar kopējo summu. 10 ml eluenta buferšķīduma (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazola).Attīrīts proteīns tika noteikts, izmantojot WB, un koncentrācija tika noteikta, izmantojot Qubit™ proteīna testa komplektu (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP testi tika veikti, kā aprakstīts iepriekš, ar modifikācijām.Īsumā, 1x RIP buferis (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNazīna ribonukleāzes inhibitors (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteāze) lizē citostatisko7 kokteili 1 x (Roche, 1 mM DTT) un centrifugējiet ar ātrumu 13 000 apgr./min 15 minūtes 4 °C temperatūrā.Pēc tam supernatantu inkubēja ar proteīna A + G magnētiskajām lodītēm (Millipore), kas konjugētas ar 5 μg anti-PACT antivielu (Abeam) vai IgG (CST).Pērlītes tika mazgātas 5 reizes ar 5x RIP buferšķīdumu, pēc tam sagremotas ar proteināzi K (NEB).RNS ekstrahēja ar Trizol un noteica ar RT-qPCR.Primeri ir parādīti 5. papildu tabulā.
In vitro RIP tests tika veikts saskaņā ar modificētu standarta RIP testa protokolu.Kopumā 5 pmol in vitro transkribētas RNS tika atšķaidīta 1x ar RIP buferšķīdumu un atkausēta, inkubējot 65 ° C temperatūrā 5 minūtes, kam sekoja lēna atdzesēšana līdz istabas temperatūrai.Kopumā no E. coli tika attīrīti 5 pmol intaktu vai mutāciju ar karogu iezīmētu PACT proteīnu.Inkubējiet ar renaturētu RNS 2 stundas 4 °C temperatūrā un izpildiet iepriekš minēto procedūru RIP analīzei pretkarogs IP.
RNS pagarinājuma analīzei 1 × 107 šūnas tika lizētas ar 1xRIP buferšķīdumu.Pēc centrifugēšanas ar ātrumu 13 000 apgr./min 15 minūtes 4 ° C temperatūrā supernatants tika iepriekš apstrādāts ar 30 μl streptavidīna magnētiskajām lodītēm (Bekmans) 2 stundas 4 ° C temperatūrā.Pēc tam attīrītais lizāts tika piegādāts ar rauga tRNS un inkubēts ar 40 pmol renaturētas RNS nakti 4 ° C temperatūrā, pēc tam vēl 2 stundas un pievienoja 20 μl jaunas streptavidīna magnētiskās lodītes, kas bloķētas ar BSA.Mazgāšanas posms sastāvēja no 4 reizes ar 5x RIP buferi un 4 reizes ar 1x RIP buferi.Atbilstošie proteīni tika eluēti ar biotīna eluēšanas buferi (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotīns, PMSF) un atdalīti uz NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Pēc sudraba krāsošanas (Beyotime Biotechnology) noteiktas joslas tika izgrieztas un analizētas ar MS.
Tika veikta ko-IP analīze, lai pārbaudītu PACT un PKR mijiedarbību.Īsumā, supernatanta lizāti tika sagatavoti, inkubējot 1 x 107 lizētas šūnas 1 x RIP buferšķīdumā, kam sekoja centrifugēšana ar ātrumu 13 000 apgr./min 15 minūtes 4 ° C temperatūrā.Lizāti tika ielādēti ar proteīna A + G magnētiskajām lodītēm, konjugēti ar 5 µg anti-PACT antivielas un viegli pagriezti nakti 4 ° C temperatūrā.Pērlītes tika mazgātas 3 reizes ar 5 × RIP buferšķīdumu, divas reizes ar 1 × RIP buferšķīdumu un eluētas ar 1 × SDS buferšķīdumu.Atgūtais proteīns tika analizēts ar SDS-PAGE gēlu un noteikts ar WB.
Divi pmol atzīmētā PACT un 1 pmol PKR tika attīrīti no E. coli.Atšķaida 1 × RIP buferšķīdumā un inkubē ar 10 pmol renaturētas RNS 2 stundas 4 °C temperatūrā.Pēc tam tos vēl divas stundas inkubēja ar proteīna A + G magnētisko lodīšu konjugētu anti-marķētu antivielu.Pēc tam lodītes četras reizes mazgāja ar 1x RIP buferšķīdumu un eluēja ar 1x SDS buferi.Iegūto PACT un PKR atklāja WB.